İn Vitro Nöron ve Makrofaj Kokültürü Geliştirme

Bir büyüme ortamında izole edilmiş murin dorsal kök ganglion nöronları ile başlayın.

Nöronal bağlanmayı teşvik etmek için bunları polimer kaplı çok kuyulu bir plakaya tohumlayın.

Daha sonra, disseke edilmiş ötenazi yapılmış bir fare alın ve buz gibi soğuk PBS'yi periton boşluğuna enjekte edin.

Makrofajları periton duvarından çıkarmak için peritona hafifçe masaj yapın.

Periton sıvısını toplamak için fareyi sıkın ve kirletici olarak görünen kırmızı kan hücrelerini seçici olarak parçalamak için bir lizis tamponu ile tedavi edin. Hücreleri bir kültür ortamında santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin.

Makrofajları, kültürlenmiş nöronları içeren kuyu içine yerleştirilmiş gözenekli bir eke aktarın.

Bu ko-kültür, nöronların ve makrofajların yakın mesafede olmasını sağlar.

Ko-kültürü db-cAMP ile muamele edin ve hücrelere girişini kolaylaştırmak için inkübe edin. Bu, sinyal moleküllerini salgılamak için nöronları aktive eder.

Bu sinyal molekülleri, db-cAMP ile birlikte, makrofajları pro-rejeneratif bir fenotipi benimsemeye ve nöronal büyüme için temel faktörleri salgılamaya teşvik eder.

Kültürü kurmadan önce, poli-D-lizin ve laminin ile 6 oyuklu bir plakayı önceden kaplayın. Daha sonra, 6 oyuklu plakayı 0.01 poli-D-lizin ile 37 santigrat derecede iki saat veya gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, plakayı iki kez damıtılmış suyla yıkayın.

Daha sonra, plakayı oda sıcaklığında iki saat boyunca mililitre başına 3 mikrogram konsantrasyonda laminin çözeltisi ile inkübe edin. Bunu takiben, plakayı iki kez damıtılmış suyla yıkayın ve plakayı oda sıcaklığında en az bir saat kurutun.

Şimdi, ötenazi uygulanmış bir farenin vertebral kolonunun üzerindeki cildi cerrahi bir bıçakla kesin ve vertebral kemikleri ortaya çıkarmak için paravertebral kasları iki taraflı olarak inceleyin. DRG tamamen açığa çıkana kadar dar uçlu bir cerrahi rondür kullanarak omur kemiklerini titizlikle çıkarın.

Diseksiyon mikroskobu altında, iridektomi makası ve ince uçlu forseps kullanarak DRG'yi S1'den C1 seviyesine kadar bilateral olarak çıkarın. DRG'yi, kesik uçlu mavi bir pipet ucu kullanarak 1,5 mililitrelik bir Eppendorf tüpüne aktarın.

Ardından, bir mini santrifüj kullanarak birkaç saniye hızlı bir dönüşten sonra DMEM'i çıkarın. Mililitre tip-11 kollajenaz başına 125 birim içeren 1 mililitre DMEM ekleyin ve tüpü 37 santigrat derecede bir büküm veya çalkalayıcı kullanarak hafif bir döndürme ile 90 dakika inkübe edin.

Daha sonra, kollajenaz içeren DMEM'i atın ve 1 mililitre taze DMEM ekleyin. DRG'yi, kesik uçlu mavi bir pipet ucu kullanarak 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ardından, homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için en az 15 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

Tüpü 239 g'da üç dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yüzen döküntülerle dikkatlice atın. B27 ile takviye edilmiş 1 mililitre nörobazal ortam ekleyin ve beş ila 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Daha sonra, toplanan tüm DRG nöronlarını 6 oyuklu plakanın iki kuyucuğuna yerleştirin.

Yetişkin bir fareden primer peritoneal makrofajları hazırlamak için, peritonu ortaya çıkarmak için karın derisini hassas bir şekilde kesin ve lavaj sıvısının sızmasını önlemek için peritonu kesmekten kaçının.

Daha sonra, 22 gauge iğneli bir şırınga kullanarak peritonu delin ve periton boşluğuna 10 mililitre buz gibi soğuk PBS enjekte edin. Peritona bir ila iki dakika hafifçe masaj yapın. Daha sonra iğneyi dışarı çekin ve PBS'yi iğne delme bölgesinden sıkın ve lavaj sıvısını 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.

Daha sonra, hücresel bileşenleri peletlemek için lavaj sıvısını 239 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, peleti 3 mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile oda sıcaklığında üç dakika boyunca tekrar askıya alın.

Ardından, hücre süspansiyonunu 239 santigrat derecede 10 dakika boyunca 4 g'da tekrar santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri 1 mililitre nörobazal B27 ortamında yeniden süspanse edin. Toplanan tüm makrofajların yarısını, ayrışmış DRG kuyusunun üzerine yerleştirilen, 4.2 santimetre karelik etkili bir alana sahip bir hücre kültürü eki üzerine plakalayın.

Nöron makrofajı birlikte kültürlendikten dört saat sonra, nöron makrofaj ko-kültürlerine 2 mikrolitre 100 mikromolar db-siklik AMP çözeltisi ekleyin. 24 saat sonra, aynı 6 oyuklu plakada boş bir kuyuyu 1 mililitre makrofaj kültürü ortamı ile doldurun.

Nöron makrofaj ko-kültüründeki hücre kültürü ekini, makrofaj kültür ortamı ile boş kuyuya aktarın.