Nöron uzantılarını teşvik etmek için makrofaj şartlandırılmış bir ortam kullanma

JoVE Encyclopedia of Experiments

Sinirbilim

0 görüntüleme • 3:32 dk • July 8th, 2025

Çeşitli hücresel fonksiyonları düzenleyen bir sinyal molekülü olan siklik adenozin monofosfat veya cAMP ile başlayın. Bir nöron-makrofaj ko-kültürüne cAMP ekleyin.

Ortamdan gelen cAMP molekülleri ve nöronlardan gelen büyüme faktörleri makrofaj aktivasyonunu tetikler.

Aktive edilmiş makrofajlara sahip ek parçayı, bir makrofaj kültürü ortamı içeren başka bir kuyucuğa aktarın.

Burada, makrofajlar ortama sitokinler ve kemokinler salarlar ve şartlandırılmış bir ortam veya CM oluştururlar.

Hücresel bileşenleri peletlemek için CM'yi santrifüjleyin.

Hücresel kalıntıları gidermek için süpernatanı ve filtreyi aktarın.

Toplanan CM'yi bir nöronal kültüre ekleyin. Toplanan CM'deki sitokinler ve kemokinler nöron uzantılarını teşvik eder.

Hücreleri sabitlemek için soğutulmuş paraformaldehit ekleyin.

Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bir bloke edici tampon ekleyin. Kalan tamponu çıkarmak için yıkayın.

Nöronların hücre iskeleti proteinlerini hedef alan birincil antikorları uygulayın. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.

Primer antikorlara bağlanan kırmızı florofor konjuge ikincil antikorlar ekleyin. Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.

Floresan mikroskobu kullanarak, kırmızı renkli nöronları uzantıları ile görselleştirin.

Nöron makrofajı birlikte kültürlendikten dört saat sonra, nöron makrofaj ko-kültürlerine 2 mikrolitre 100 mikromolar db-cAMP çözeltisi ekleyin. 24 saat sonra, aynı 6 oyuklu plakada boş bir kuyuyu 1 mililitre makrofaj kültürü ortamı ile doldurun.

Nöron makrofaj ko-kültüründeki hücre kültürü ekini, makrofaj kültür ortamı ile boş kuyuya aktarın. 72 saat sonra, hücresel bileşenleri çıkarmak için makrofaj şartlandırılmış ortamı 239 g'da beş dakika boyunca santrifüjleyin. Kalan hücresel kalıntıları temizlemek için süpernatanı 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin.

Bu prosedürde, 8 oyuklu bir odacıklı slaytı poli D-lizin ve laminin ile önceden kaplayın. Daha sonra, B 27 ile desteklenmiş nörobazal ortamda ilişkili yetişkin DRG nöronlarını elde edin. Plaka: 5 x 10,Kuyucuk başına 4 hücre, önceden kaplanmış 8 oyuklu bir hazne kızağı üzerine.

Daha sonra, hazne sürgüsünü iki saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin tabana yapışmasına izin verin. Ardından, kültür ortamını 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış çözülmüş şartlandırılmış bir ortamla değiştirin. İlk kaplamadan 15 saat sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın.

Daha sonra, kuyucuklara 200 mikrolitre buz gibi% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve hücreleri paraformaldehit çözeltisi ile 4 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, sabit hücreleri, oda sıcaklığında dört saat veya gece boyunca 4 santigrat derecede% 10 normal keçi serumu ile seyreltilmiş birincil antikor çözeltisi ile inkübe edin. Daha sonra, nörit büyümesini görselleştirmek için bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüler çekin.

09:23

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:02

Primer Nöronlarda Neurite Outgrowth Çalışma için Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein Tabanlı Test

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:41

İnsan Nöral Progenitor Hücre Kaynaklı Nöronlar ile Bir Neurite Outgrowth Assa ve Nörotoksisite Değerlendirmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:34

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:44

İn Vitro Nöron ve Makrofaj Kokültürü Geliştirme

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:03

Hızlı Nörit Ekstansiyonu ve Fonksiyonel Nöronal Bağlantıların Oluşumunun Başlatılması

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:28

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:54

Nucleofection İnsan THP-1 Makrofagların Yüksek Verimli Transfeksiyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:46

Makrofaj koloni stimüle edici faktör farklılaştırılmış insan monosit türevli makrofajlar Kültür

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:52

Nöron-makrofaj ortak kültürler moleküler faktörler Neurite çıkıntı aktivitesiyle salgılayan makrofajlar etkinleştirmek için

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026