JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 4:51 dk. • July 8th, 2025
Ötenazi yapılmış bir sıçan alın.
Karnı açın, mesaneyi çıkarın ve tampona batırın.
Mesaneyi kesin ve yapışan yağ ve doku kalıntılarını çıkarın.
Mesaneyi tampon, santrifüj içeren bir tüpe aktarın ve kalıntıları temizleyin.
Dokuyu kollajenaz içeren bir solüsyona yerleştirin ve kıyın. Hücre dışı matrisi bozmak için daha fazla kollajenaz ekleyin ve hücreleri gevşetin.
Süpernatanı santrifüjleyin ve atın. Hücre-hücre bağlantılarını bozmak için tripsin ekleyin ve hücreleri serbest bırakın.
Tripsini inaktive etmek için protein içeren durulama ortamı ekleyin, ardından santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Ortamdaki hücreleri yeniden süspanse edin; agregaları çıkarmak için filtreleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde edin.
Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın. Ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın.
Nöronal ve glial hücre bağlanmasını kolaylaştırmak için hücreleri kaplanmış lameller üzerine yerleştirin. Bağlı olmayan hücreleri çıkarın.
Hücresel olgunlaşmayı teşvik etmek, birincil nöronal ve glial kültür oluşturmak için büyüme faktörleri içeren nöron ortamı ekleyin.
Fareleri sterilize edilmiş bir cerrahi havluya yerleştirerek ve karnı açığa çıkararak başlayın. Karın boşluğunu açmak ve mesaneyi ortaya çıkarmak için makas ve forseps kullanın. Mesaneyi nazikçe kaldırmak ve mesane boynundan kesmek için başka bir makas ve forseps seti kullanın.
Ardından, hücre sağkalımını iyileştirmek için mesaneyi hızla soğuk, oksijene dayanıklı Krebs çözeltisine yerleştirin. Krebs çözeltisini üç cam tabağa ve üç cam behere ekleyin ve ön soğutma için bir buz banyosuna koyun. Karışıklığı önlemek için tabakları ve beherleri 1, 2 ve 3 olarak numaralandırın.
Cam tabak 1'de mesaneyi oftalmik makasla açın ve forseps ve bir kaşık çekirdek bölücü ile açın. Mesaneyi cam beherde 1 durulayın ve cam kabın 2 içine yerleştirin. Forseps ve oftalmik makas kullanarak doku yüzeyindeki yapışkan yağları ortadan kaldırın. Daha sonra mesaneyi beher 2'de durulayın ve tabak 3'e yerleştirin.
Ekzojen ataşmanları çıkarmak için forseps ve kaşık çekirdek bölücüyü kullanarak mesaneyi nazikçe kazıyın. Mesaneyi cam beher 3 içinde durulayın ve 14 mililitre soğuk Krebs çözeltisi ile 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 360 kez g ve 4 santigrat derecede 1 dakika santrifüjleyin.
Mesaneyi santrifüj tüpünden 1 mililitre sindirim çözeltisi içeren 2 mililitrelik bir şişeye aktarın. Mesaneyi küçük parçalara ayırmak için oftalmik makas kullanın. Mesane solüsyonunu steril bir hücre kültürü kabında 9 mililitre sindirim solüsyonu 1 ile karıştırın. İlk sindirimi çalkalama makinesinde, 37 santigrat derecede 1 saat ve 200 RPM'de% 5 karbondioksit ile gerçekleştirin. İlk sindirimden sonra, çözeltiyi 8 dakika boyunca 300 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin.
Bu arada, sindirim solüsyonu 2'yi ön ısıtma için 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirin. Santrifüjlemeden sonra, sindirim çözeltisi 1 içeren süpernatantın çoğunu çıkarın ve hücre kaybını önlemek için bir miktar süpernatant bırakın.
Hücreleri ılık sindirim solüsyonu 2'de tekrar süspanse edin ve 37 derecelik bir su banyosunda 5 dakika boyunca sindirirken karışımı çalkalayın. Sindirim tamamlandıktan sonra, 10 mililitre soğuk durulama ortamı ekleyerek tripsini hemen devre dışı bırakın. Hücreleri 360 kez g ve 4 santigrat derecede 8 dakika santrifüjleyin. Ardından, tüm tripsini ortadan kaldırmak için mümkün olduğunca fazla süpernatanı çıkarın.
Tortuyu 3 mililitre nöron ortamı ile nazikçe yeniden süspanse edin ve çözeltide hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin. Süspansiyonu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne süzün. Hücreleri 360 kez g'de 4 santigrat derecede 8 dakika santrifüjleyerek toplayın. Daha sonra, hücre peletlerini 1 mililitre nöron ortamı A'da nazikçe yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültür hücreleri.