Plastik Mikroakışkan Çipler Kullanılarak Bölümlere Ayrılmış Primer Murin Nöron Kültürü

Somatik rezervuarlar ve bölmelerin yanı sıra mikro oluklarla birbirine bağlanmış aksonal rezervuarlar ve bölmelerden oluşan plastik bir mikroakışkan çip alın.

Bölmeleri ve olukları doyurmak için bir ön kaplama solüsyonu ekleyin ve hava kabarcığı sıkışmasını önleyin.

Ana bölmeleri dolu bırakarak çözeltiyi aspire edin. Tampon ile yıkayınız.

Kuyucukları, nöronal yapışmayı kolaylaştıran sentetik bir polimer ile kaplayın. Tampon ile yıkayın ve talaşın kurumasını önlemek için kültür ortamı ekleyin.

Sıçan hipokampal nöronlarının bir süspansiyonunu tohumlamak için medyayı aspire edin.

Süspansiyonu somatik rezervuarlara yükleyin. Nöronlar somatik bölmeye girer ve bağlanır.

Kuyucuklara nöronal kültür ortamı ekleyin ve inkübe edin. Ortamda bulunan büyüme faktörleri nöronal büyümeyi kolaylaştırır.

Yavaş yavaş, nöronlar, mikro oluklar yoluyla aksonal bölmeye doğru büyüyen aksonlarını uzatır.

Olukların darlığı, nöronal hücre gövdelerinin girişini engelleyerek somatik ve aksonal bölgelerin fiziksel olarak ayrılmasını sağlar.

Başlamak için, steril bir çok bölmeli çipi bir Petri kabına yerleştirin. Çipin sol üst kuyucuğuna 100 mikrolitre ön kaplama çözeltisi ekleyin ve ana kanaldan bitişik kuyucuğa akmasına izin verin. Ardından, çipin sol alt kuyusunu 100 mikrolitre ön kaplama çözeltisi ile doldurun.

Bu sefer, çözeltinin mikro oluklardan akmasına izin vermek için beş dakika bekleyin. Şimdi, sağ üst kuyucuğa 100 mikrolitre ön kaplama çözeltisi ekleyin ve ana kanaldan bitişik kuyuya akmasına izin verin. 90 saniye sonra, sağ alt kuyuyu 100 mikrolitre ön kaplama çözeltisi ile doldurun ve çipi 10 dakika inkübe edin.

Pipet ucunu dikkatlice ana kanaldan uzağa doğru eğin ve çözeltiyi her bir kuyucuktan aspire edin. Ardından hemen sol üst kuyucuğa 150 mikrolitre PBS ekleyin ve 1,5 dakika bekleyin. Ardından, sol alt kuyucuğa 150 mikrolitre PBS ekleyin ve sıvının mikro oluklardan akmasına izin vermek için beş dakika bekleyin.

Ardından, bu sırayla sağ üst ve sağ alt kuyucuklara 150 mikrolitre PBS ekleyin. 10 dakika sonra tekrar PBS'yi aspire edin ve yıkama adımlarını ikinci kez tekrarlayın. İkinci yıkamanın ardından, pipet ucunu kanal açıklığından uzağa doğru açılandırarak PBS'yi daha önce olduğu gibi aspire edin.

Daha sonra, çipin sol üst kuyucuğuna ml poli-D-lizin çözeltisi başına 100 mikrolitre 0.5 mg ekleyin. 1 ve 1/2 dakika bekleyin ve ardından sol alt kuyuyu 100 mikrolitre poli-D-lizin çözeltisi ile doldurun. Bu işlemi çipin sağ yarısında tekrarlayın. Petri kabını kapatın, ardından çipi bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.

İnkübasyondan sonra, çipi daha önce açıklandığı gibi PBS ile iki kez durulayın. Ardından, PBS'yi cihazdan aspire edin. Hemen, çipin sol üst kuyucuğuna 100 mikrolitre hücre kültürü ortamı ekleyin. 1 ve 1/2 dakika sonra, sol alt kuyucuğa medya ekleyin.

Ortamın mikro oluklardan geçmesine izin vermek için beş dakika bekleyin ve ardından doldurma işlemini çipin sağ tarafında tekrarlayın. Belirlenmiş protokollere göre ayrışmış sıçan hipokampal nöronlarının bir hücre süspansiyonunu hazırlayın. Çipin her bir oyuğundaki ortamın çoğunu çıkarın, ancak kanalları dolu bırakın.

Daha sonra hemen sağ üst kuyucuğa 5 mikrolitre hücre süspansiyonu ve sağ alt kuyucuğa 5 mikrolitre hücre süspansiyonu daha yükleyin. Hücreleri yüklerken, pipetin ucunu ana kanala doğru tutun. Hücreleri yükledikten sonra, nöronların ana kanalda olduğundan emin olmak için çipi bir mikroskop aşamasına aktarın.

Hücrelerin yapışması için 5 dakika bekledikten sonra, sağ üst ve alt oyukların her birine yaklaşık 150 mikrolitre nöronal kültür ortamı ekleyin. Ardından, sol üst ve alt kuyucukların her birine 150 mikrolitre ortam ekleyin. Petri kabını kapatın ve çipi %5 karbondioksit 37 santigrat derece inkübatörde nemlendirilmiş bir tepsiye yerleştirin.