JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:10 dk. • July 8th, 2025
Embriyo ortamında erken gelişim evresindeki zebra balığı embriyoları ile başlayın.
Embriyoları çevreleyen koruyucu zar olan koryonu çıkarın ve embriyoları ortam içeren taze bir kültür plakasına aktarın.
Embriyonun kuyruk kısmını çıkarın, ardından başı ayırın ve gözleri yavaşça kafadan ayırın.
Gözler, retina ganglion hücrelerini barındıran ince bir doku tabakası olan retinayı içerir.
Gözleri zebra balığı hücre kültürü ortamı içeren bir tüpe aktarın.
Retinal ganglion hücrelerini serbest bırakmak ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için gözleri mekanik olarak ayırın.
Zebra balığı kültür ortamı içeren bir kültür plakasına yerleştirilmiş lamelleri alın.
Lameller sentetik bir polimer ve bir yapışma proteini ile kaplanmıştır.
Hücreleri lamel merkezine aktarın ve inkübe edin.
Retinal ganglion hücreleri kaplanmış yüzeylere bağlanır ve ayrıca bu hücreler akson adı verilen uzun çıkıntılar geliştirir.
Zebra balığı embriyolarını inkübatörden alın ve embriyoları sterilize etmek için 5 ila 10 saniye boyunca% 70 etanol içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına daldırın. Bir transfer pipeti kullanarak, fazla etanolü yıkamak için embriyoları steril E2 ortamı içeren E2 Ortamı # 1 kabına aktarın. Daha sonra embriyoları E2 Media #2 kabına aktarın ve koryonlarını keskin forsepslerle çıkarın. Son olarak, diseksiyon yapmak için embriyoları E2 Media # 3 kabına aktarın.
Bir çift ince forseps kullanarak, embriyoları forsepslerden biri ile yumurta sarısının önüne yerleştirin ve tutun ve diğer forseps ile yumurta sarısı kesesinin arkasındaki kuyruğu çıkarın. Boynunuzu forseps ile tutun ve beyni ve gözleri E2 ortamına maruz bırakmak için başınızı çıkarın. İnce forsepslerin ucuyla, ikinci forseps ile kraniyal dokuyu aşağı doğru tutarken gözleri baştan nazikçe yuvarlayın. Dört gözü ZFCM+ içeren önceden hazırlanmış tüplerden birine aktarın.
Hücreleri ayırmak için P20 pipeti ile yaklaşık 45 kez hafifçe yukarı ve aşağı öğütün. ZFCM+'yı ayrışmış hücrelerle birlikte lamellerin merkezine aktarın. Kültürleri tezgah üzerinde 22 santigrat derecede, titreşimleri emmek için polistiren köpük raf üzerinde tutun. Görüntüleme gününde, RGC aksonlarının büyümesini doğrulamak için mikroskop altında hücreleri kontrol edin.