JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:50 dk. • July 8th, 2025
Dilimleme çözeltisine batırılmış bir insan beyin dokusunu ele alalım. Çözeltinin biyolojik pH'ı ve besin maddeleri, doku işlevselliğinin korunmasına yardımcı olur.
En dıştaki meninks tabakasını çıkarın ve düz bir yüzey oluşturmak için dokuyu kesin.
Dokudaki fazla çözeltiyi kurulayın. Kesilen dokuyu bir agaroz bloğu ile bir numune diskine takın ve kesitleme kolaylığı için dokuyu blokla temas halinde tutun.
Diski bir vibratom tampon tepsisine yerleştirin ve dokuyu buz gibi soğuk bir dilimleme solüsyonu ile kaplayın.
Vibratomu kullanarak, doku mimarisini koruyan tek tip dilimler oluşturun.
Gri ve beyaz maddenin tutarlı bir oranını sağlayarak fazla dokuyu kesin.
Dilimleri bir kültür ortamı içeren çok kuyulu bir plakaya yerleştirin ve inkübe edin.
Dilimler, serbest yüzen dilim kültürü olarak bilinen bir teknik olan eşit besin erişimini sağlamak için ortamda asılı kalır.
Doku canlılığını korumak için kültürü düzenli olarak nöral büyüme faktörü takviyeli bir ortamla doldurun.
Numuneyi dilimleme çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın. İnce cerrahi aletler kullanarak, kalan meninkslerin mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın. Deneysel tasarımın belirli özelliklerine sahip dilimler üretmek için en iyi numune oryantasyonunu seçin ve numune diskine yapıştırılacak taban olacak şekilde düz bir yüzeyi kırpmak için 24 numaralı bir neşter bıçağı kullanın.
Tek kullanımlık bir plastik kaşık ve hassas boya fırçaları kullanarak, parçayı Petri kabından toplayın ve fazla çözeltiyi filtre kağıdı ile kurulayın. Ardından, dokuyu tabağa sıkıca yapışana ve agaroz bloğu ile temas edene kadar vibratom numune kabına tutturmak için süper yapıştırıcı kullanın.
Vibratom numune diskini vibratom tampon tepsisine yerleştirin. Tıraş bıçağı sıkıca sabitlenmiş halde bıçak tutucuyu yerine kilitleyin. Dilimleme solüsyonu ekleyin ve hem numuneyi hem de bıçağı kapladığından emin olun. Ardından, numuneyi 200 mikrometrelik dilimler halinde dilimlemeye başlayın.
Dilimleri tampon tepsisinden dilimleme solüsyonu içeren bir Petri kabına aktarın ve gevşek kenarları ve fazla beyaz maddeyi yaklaşık %70 korteks ve %30 beyaz madde oranına kadar kesin. Laminer bir akış kabininde, 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 600 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve dilimleri kaplamadan önce en az 20 dakika boyunca% 5 karbondioksit ile 36 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, her bir oyuğa bir dilim koymak için bir boya fırçası kullanın.
Plakada kullanılmayan kuyular varsa, bunları 400 mikrolitre steril su ile doldurun. % 5 karbondioksit ile 36 santigrat derecede inkübe edin. Önceden hazırlanmış kültür ortamının 10 mililitresini, mililitre başına 50 nanogram konsantrasyonda beyin kaynaklı nörotrofik faktör ile takviye edin.
8 ila 16 saat sonra, her bir oyuktan 333 mikrolitre şartlandırılmış ortamı çıkarın ve 133 mikrolitre taze BDNF takviyeli ortam ekleyin. Şartlandırılmış ortamın üçte birini her 24 saatte bir taze BDNF takviyeli ortamla değiştirin.