Sıçan Beyinlerinden Serumsuz Besiyeri Kullanılarak Mikroglia İzolasyonu ve Kültürü

Perfüze edilmiş bir sıçan beyni alın. Küçük parçalar halinde kıyın.

Mikroglia da dahil olmak üzere hücreleri serbest bırakmak için dokuyu bir tampon içinde homojenize edin.

Sindirilmemiş doku çöktüğünde, süpernatan içeren hücreleri toplayın ve bir miyelin ayırma tamponu ekleyin.

Hücreleri miyelin ve döküntülerden ayırmak için içeriği karıştırın ve santrifüjleyin. Miyelin kalıntı tabakasını ve süpernatanı çıkarın.

Kümeleri ayırmak için hücreleri tampon ve pipette yeniden askıya alın.

Kalan hücre agregalarını çıkarmak için süspansiyonu bir süzgeçten geçirin.

Filtrelenmiş hücreleri, mikrogliaya özgü monoklonal antikorlarla kaplanmış bir kültür plakasına aktarın. Mikroglia yapışmasını kolaylaştırmak için inkübe edin.

Yapışmayan hücreleri çıkarmak için tamponla yıkayın. Tripsin ekleyin ve mikroglia'yı gevşetmek için inkübe edin.

Tripsin çıkarın.

Serumsuz ortam ekleyin. Hücre-substrat etkileşimlerini zayıflatmak için buz üzerinde inkübe edin.

Süspansiyonu pipetleyin ve bir tüpte toplayın. Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

Mikroglia'yı serumsuz ortamda yeniden süspanse edin ve kollajen kaplı çok kuyulu bir plakaya aktarın. Mikroglia yapışmasını kolaylaştırmak için inkübe edin.

Büyüme faktörleri ve lipitler içeren ortamlar ekleyin. Mikroglia olgunlaşması için kuluçkaya yatırın.

Beyinler soğuk DPBS'de toplandıktan sonra, her bir beyni soğuk bir neşter bıçağıyla buz üzerinde bir Petri kabında bir milimetre küp parçalar halinde doğrayın ve 5 ila 7 mililitre buz gibi soğuk douncing tamponu ile buz gibi bir Dounce homojenizatöre aktarın. Ardından, dokuyu 10 ila 20 yumuşak ve eksik vuruşla ayırmak için gevşek oturan bir Dounce homojenizatör kullanın. Homojenizatörün altındaki dokuyu doğrudan ezmemeye dikkat edin. Bunun yerine, dokuyu pistonun kenarları ile homojenizatör arasındaki boşluktan itin.

Mikroglia canlılığını korumak için dokuyu birden fazla douncing turu ile yavaşça homojenize etmek önemlidir.

Daha sonra, hava kabarcıklarının girmesini önlemek için pistonu dikkatlice çıkarın. Zayıf ayrışmış doku parçalarının homojenizatörün dibine çökmesine izin verin ve süpernatanı yeni, soğutulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, çıkarılan hacmi yeni douncing tamponu ile değiştirin ve ayrışma prosedürünü toplam üç ila dört tur boyunca veya tüm doku ayrışana kadar tekrarlayın.

Bu prosedürde, hücre süspansiyonunu içeren 50 mililitrelik konik tüpe buz gibi soğuk douncing tamponu ekleyin ve toplam hacmi 33,5 mililitre olarak ayarlayın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 10 mililitre MSB ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Bu, 43.5 mililitrelik bir hacimde% 23'lük bir nihai MSB konsantrasyonu ile sonuçlanacaktır.

Bundan sonra, hücreleri yavaş frenleme ile 4 santigrat derecede 500 g'da 15 dakika santrifüjleyin. Ardından, miyelinin üst tabakasını ve kalıntıları ve süpernatanı bir pipetle çıkarın. Mümkün olduğunca fazlasının çıkarıldığından emin olmak için üst tabakayı çıkarırken dikkatli olun.

Bunu takiben, hücre peletini 12 mililitre kaydırma tamponunda yeniden süspanse edin. Kalan hücre kümelerini parçalamak için hücre süspansiyonunu nazikçe ezin. Bu adımda, büyük kalıntıları veya hücre kümelerini çıkarmak için hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. OX42 kaplı kaydırma kabını DPBS ile üç kez durulayın. Yıkamalar arasında plakanın tamamen kurumasına izin vermeyin.

Son DPBS yıkamasını dökün ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu kaydırma kabına uygulayın. Hücreleri dağıtmak için plakayı hafifçe döndürün. Ardından, hücrelerin yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında düz bir yüzeyde 20 dakika inkübe edin. 20 dakikadan daha uzun süre kuluçkaya yatırmayın, aksi takdirde hücrelerin tabaktan kurtarılması çok zorlaşır. Daha sonra, yapışmayan hücreleri çıkarmak için kaydırma kabını DPBS ile 10 kez durulayın.

Mikroglia plakaya sıkıca tutturulacaktır, bu nedenle diğer yapışmayan hücrelerin çıkarılmasını sağlamak için her durulamada plakayı döndürün. Son DPBS yıkamasını dökün ve 15 mililitre DPBS ve 200 mikrolitre tripsin ile değiştirin.

Hücreleri denemek için, tabağı 37 santigrat derecede 10 dakikaya eşit veya daha az bir süre inkübe edin. 10 dakikalık tripsinizasyondan sonra, mikroglia hala plakaya yapışacaktır. Karışımı dökün ve tripsini çıkarmak için plakayı DPBS ile iki kez hafifçe yıkayın. Ardından, 12 mililitre buz gibi MGM ile değiştirin.

Daha sonra, hücre ve substrat etkileşimini zayıflatmaya yardımcı olmak için kaydırma kabını iki dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve kaydırma kabının alanlarının kurumasını önlemek için kabın düz olduğundan emin olun. Bundan sonra, kaydırma kabından hücreleri kurtarmak için 10 mililitrelik bir pipet ve pipet kontrol cihazı ile yüksek hızda kuvvetlice pipetleyin. Tüm hücreleri denemek ve çıkarmak için pipetten gelen sıvı akışıyla 16'ya 16'lık bir ızgara çizin.

Genel hücre geri kazanımı ile kültürünüzün sağlığı arasında bir denge bulmak önemlidir. Bir hücre süpernatantının kaydırma kabına karşı tekrar tekrar pipetlenmesi, kültürünüzün canlılığının azalmasına neden olacaktır.

Plakadan ayrıldıklarından emin olmak için hücreleri 20x büyütmede mikroskop altında kontrol edin. Tabağın üst kısmında hücrelerin sıkıştığı noktaları işaretleyin ve bu alanlarda pipetlemeyi tekrarlayın. Hücre süspansiyonunu toplayın ve her 15 mililitrelik konik tüpte 3 ila 4 mililitre süpernatan alın. Yavaş frenleme ile 4 santigrat derecede 500 g'da 15 dakika döndürün.

15 dakika sonra, süpernatanı aspire edin ve hücre peleti ile 0,5 mililitre MGM bırakın. Ardından, kalan MGM'deki her bir peleti yeniden süspanse edin ve hücreleri tüm tüplerden toplayın. Bunu takiben, hemositometre ile hücreleri sayın.

Şimdi, 15 mikrolitre kollajen IV kaplamayı doğrudan 24 oyuklu anyonik, katyonik kaplı doku kültürü plakasının ortasına yerleştirin ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Hücreleri bir hemositometre ile saydıktan sonra, MGM'de mililitre başına 2.3 x ^10-5'e seyreltin. Kollajen IV noktasını aspire edin ve hemen bu noktaya 15 mikrolitre hücre süspansiyonu uygulayın ve nokta başına 3.5 x 10³ hücre elde edin.

Daha sonra, hücrelerin yapışmasını sağlamak için 37 santigrat derecede beş ila on dakika inkübe edin. Ardından, kuyuya yavaşça 500 mikrolitre CO₂ dengelenmiş TIC ekleyin.