$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İzole edilmiş bir beyinle başlayın. Metabolik süreçleri duraklatmak için beyni hızla önceden soğutulmuş bir yapay beyin omurilik sıvısına veya aCSF'ye daldırın.
aCSF, nöronal hücre hasarını ve ölümünü azaltan büyük bir organik katyon olan NMDG içerir.
aCSF ayrıca pH ve tuz konsantrasyonunu koruyan ve hücre şişmesini ve hasarını önleyen HEPES içerir.
Beyni, bir filtre kağıdı içeren bir Petri kabına aktarın.
İstenilen bölgeyi elde etmek için beyni kesin.
Beyin bloğunu uygun bir yapıştırıcı kullanarak numune tutucuya sabitleyin ve agarozun içine gömün.
Numune tutucuyu dilimleyiciye yerleştirin.
Dilimleyicinin haznesini önceden soğutulmuş aCSF ile doldurun ve optimum oksijen kaynağı sağlamak için çözeltiyi havalandırın.
Beyin bloğunun bölümlerini elde edin.
Metabolik süreçleri yeniden başlatmak için bölümleri önceden ısıtılmış aCSF'ye aktarın ve bölümlerin iyileşmesini sağlayın.
Sağlam beyni, önceden soğutulmuş NMDG-HEPES aCSF'nin kabına nazikçe çıkarın ve beynin yaklaşık 1 dakika boyunca eşit şekilde soğumasına izin verin. Şimdi, beyni beherden filtre kağıdı ile kaplı Petri kabına aktarmak için büyük bir spatula kullanın.
Beyni, tercih edilen dilimleme açısına ve istenen beyin ilgi bölgesine göre kesin ve monte edin. Kullanım sırasında uzun süreli oksijen yoksunluğunu önlemek için hızlı çalışın. Daha sonra, yapışkan yapıştırıcı kullanarak beyin bloğunu numune tutucuya yapıştırın.
Beyin bloğunu tamamen içeri çekmek için numune tutucunun iç parçasını geri çekin. Ardından, erimiş agarozu, beyin bloğu tamamen agarozla kaplanana kadar doğrudan tutucuya dökün. Daha sonra, önceden soğutulmuş aksesuar soğutma bloğunu, agaroz katılaşana kadar numune tutucunun etrafına 10 saniye boyunca sıkıştırın.
Numune tutucuyu dilimleme makinesindeki yuvaya yerleştirin ve doğru hizalamayı doğrulayın. Bunu takiben, rezervuarı 250 mililitrelik beherden kalan önceden soğutulmuş, oksijenli NMDG-HEPES aCSF ile doldurun ve yeterli oksijenasyonu sağlamak için dilimleme süresi boyunca rezervuara bir kabarcık taşı yerleştirin.
Ardından, agaroza gömülü beyin örneğini ilerletmeye başlamak için mikrometreyi ayarlayın. Dilimleyiciyi başlatın ve gelişmiş hızı ve salınım frekansını ampirik olarak istenen seviyeye ayarlayın. İlgilenilen beyin bölgesi tamamen kesilene kadar dokuyu 300 mikrometrelik artışlarla ilerletmeye ve dilimlemeye devam edin. Dilimleme işlemi için toplam süre 15 dakikadan az olmalıdır.
İlk NMDG geri kazanımı için, kesit alma prosedürünün tamamlanmasının ardından, tüm dilimleri kesilmiş bir plastik Pasteur pipeti kullanarak toplayın ve bunları 150 mililitre NMDG-HEPES aCSF ile doldurulmuş 34 santigrat derecelik bir geri kazanım odasına aktarın.
Akut beyin dilimi kurtarma adımının zamanlaması, morfolojik koruma ile her bir nöronun elektrofizyolojik özelliklerinin fonksiyonel olarak geri kazanılması arasında bir denge kurabilmek için çok önemlidir.