Fare Subkallozal Bölgesinden Erişkin Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Soğutulmuş bir beyin matrisinde bir fare beyni ile başlayın.

Subkallozal bölgeyi veya SCZ'yi içeren bölümleri elde edin. Bölümü soğuk bir fosfat tamponuna aktarın.

Diseksiyon mikroskobu altında, SCZ kısmını kesin.

Parçalanmış SCZ'yi daha küçük parçalar halinde doğrayın.

Bu parçaları bir sindirim tamponuna aktarın. Hücreleri dokudan ayırmak için inkübe edin.

Süpernatanı santrifüjleyin ve atın. Hücreleri uygun bir ortamda yeniden süspanse edin.

Hücreleri bir kültür plakasına aktarın ve spesifik büyüme faktörleri ekleyin.

Yetişkin nöral kök hücreler bölünerek nörosfer adı verilen kümeler oluşturur.

Hücre kümelerinde uygun olmayan besin dağılımı hücre büyümesini sınırlar.

Kümeleri dağıtmak için süpernatanı santrifüjleyin ve atın. Kümeleri bir ayrışma tamponunda yeniden askıya alın ve inkübe edin.

Tek hücreler oluşturmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin.

Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Hücreleri yeniden süspanse edin ve tek tabaka elde etmek için uygun bir ortama aktarın.

Diseke edildikten sonra, fare beynini soğuk PBS tamponuna aktarın ve fazla kanı çıkarmak için iki kez durulayın. Daha sonra, beyni buz üzerindeki beyin matrisine yerleştirin ve bir milimetre kalınlığında dilimler elde etmek için koronal kesimler yapın. Daha sonra, SCZ bölgelerini içeren arka beyin dilimlerini soğuk PBS'ye aktarın.

Düşük büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altında, SCZ'yi korteksin beyaz madde alanından ve hipokampustan bükülmüş 30 gauge bir iğne ile mikrodiseksiyon yapın. Daha sonra, SCZ'nin üzerindeki korteks bölgelerini çıkarın ve disseke edilmiş SCZ'yi buz üzerinde 35 milimetrelik bir Petri kabındaki soğuk PBS'ye yerleştirin.

Subkallozal bölge bölgesi, beyin matriksi ve bükülmüş 30 gauge iğne kullanılarak tüm dokudan hassas bir şekilde diseke edilebilir.

Bunu takiben, PBS'yi çıkarın ve ardından disseke edilen dokuları hemen küçük parçalar halinde doğrayın. Onları bir mililitre sindirim tamponu ile tekrar süspanse edin. Daha sonra, numuneyi iki mililitre sindirim tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika inkübe edin.

Bu adımda, sindirilmiş dokuyu ayırmak için tüpe hafifçe vurun ve ardından tüpü beş dakika boyunca 145 kez g'de santrifüjleyin. Beş dakika sonra, süpernatanı atın, sindirim tamponunu yıkamak için sindirilmiş dokuyu bir mililitre önceden ısıtılmış ve iki orta ile yeniden süspanse edin ve numune çözeltisini en fazla beş kez nazikçe pipetleyin.

Daha sonra, numuneyi beş dakika boyunca 145 kez g'de tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre N2 ortamında yeniden süspanse edin. Kaplanmamış altı oyuklu bir plakaya bir mililitre N2 ortamı yerleştirin ve iki mililitrelik bir son hacim elde etmek için bir mililitre asılı hücre ekleyin.

Daha sonra, her bir oyuğa mililitre EGF başına 20 nanogram ve mililitre bFGF başına 20 nanogram ekleyin. Eklenen büyüme faktörlerini kaplanmış hücrelerle karıştırmak için altı oyuklu kültür kabını elle hafifçe çalkalayın. Ardından, altı oyuklu plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörde tutun.

Sekiz gün boyunca her gün her kuyucuğa mililitre EGF başına 20 nanogram ve mililitre bFGF başına 20 nanogram ekleyin. Her üç günde bir, ortamın yaklaşık iki mililitresini korumak için 200 mikrolitre N2 ortamı ekleyin. İşte sekiz gün sonra nörosferlerin bir görüntüsü.

Bu prosedürde, nöroküreleri toplayın ve bunları 15 milimetrelik yeni bir konik tüpe aktarın. Tüpü beş dakika boyunca 145 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve nörosferleri 0.5 mililitre ayrışma tamponu ile yeniden askıya alın. Nörosferleri tek hücrelere ayırmak için 37 santigrat derece su banyosunda beş dakika boyunca 0,5 mililitre ayrışma tamponu ile inkübe edin.

Numune çözeltisini beş defadan daha az bir süre yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin ve tüpü beş dakika boyunca 145 kez g'de santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın ve nörosferleri bir mililitre N2 ortamı ile yeniden süspanse edin. Altı oyuklu bir plakayı PLL laminin ile kapladıktan sonra, hücreleri mililitre başına 2.5 x 10⁵ hücrede iki mililitre N2 ortamı ile kaplayın. SCZ yetişkin nöral kök hücrelerini, onları geçmeden önce beş gün boyunca günlük büyüme faktörleri tedavisi ile koruyun.