JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:46 dk. • July 8th, 2025
Bir biyoreaktörde insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri veya iPSC'leri tohumlayın. iPSC'ler, hücresel apoptoz inhibitörü içeren bir ortamda yeniden süspanse edilir.
Manyetik bir alan altında, biyoreaktörün dikey tekerleği kontrollü bir hızda dönerek hücre-hücre temasını ve agrega oluşumunu kolaylaştırır. Ortamın çoğunu çıkarın ve inhibitör olmadan yeni ortam ekleyin.
Kültürlemeye devam edin. Agregalar en uygun boyuta ulaştığında, yerçekimi ile yerleşmelerine izin verin. Ortamı çıkarın.
Büyüme faktörleri içeren farklılaşma ortamı ekleyin ve azaltılmış biyoreaktör çark hızına sahip kültür ekleyin. Büyüme faktörleri, agregalar içinde nöral farklılaşmayı teşvik eder.
Daha sonra, serebellar progenitörlerin gelişimini indükleyen büyüme faktörleri ve kemokinlerle desteklenmiş taze ortam ekleyin.
Yavaş yavaş, serebellar progenitörler, agregalar içinde farklı katmanlar halinde organize olur ve erken serebellar organoidler oluşturur.
Son olarak, belirli nörotrofik faktörler içeren bir nöronal ortam ekleyin.
Bu faktörler, sinaptik olarak aktif fonksiyonel serebellar nöronlara serebellar progenitör olgunlaşmasını indükleyerek olgun organoidler oluşturur.
1. günde, 0. gün biyoreaktörün tohumlanma günü olmak üzere, biyoreaktörü ve ana üniteyi steril bir akış başlığına yerleştirin. Ardından, hücre süspansiyonunun 1 mililitrelik bir örneğini toplamak için serolojik bir pipet kullanın. Hücre süspansiyonunu ultra düşük bağlantılı 24 oyuklu bir plakada plakalayın. iPSC'den türetilmiş agregaların oluştuğunu doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Öyleyse, agregaların görüntülerini 40x veya 100x'te yakalayın.
Agregaların ortalama çapı 100 mikrometre olana kadar iPSC'leri biyoreaktörde kültürlemeye devam edin. Ardından, ortamın %80'ini ROCK inhibitörü olmayan taze mTesR1 ile değiştirin. Agregaların çapı 200 ila 250 mikrometreye ulaştığında, tüm organoidlerin biyoreaktörün dibine yerleşmesine izin verin. Ardından, harcanan tüm ortamı gfCDM farklılaşma ortamıyla değiştirin.
Ana üniteyi ve biyoreaktörü inkübatöre yerleştirin ve çalkalamayı 25 RPM'ye düşürün.