JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 6:18 dk • July 8th, 2025
Bir tümör içeren perfüze bir fare beynini ele alalım.
Perfüzyon basamağı, dolaşımdaki bağışıklık hücrelerini uzaklaştırır, ancak tümöre sızan hücreleri tutar.
Tümörü içeren dokuyu izole edin.
Şimdi, dokuyu mekanik olarak ayırın.
Mekanik kuvvet dokuyu gevşeterek hücreleri serbest bırakır.
Ayrışmış dokuyu bir tüpe aktarın.
Süpernatan içeren kalıntıları santrifüjleyin ve atın.
Dokuyu kollajenaz ve DNaz içeren bir sindirim solüsyonunda yeniden süspanse edin.
Kollajenaz, hücre dışı matrisi bozarak hücreleri serbest bırakır. DNaz, kirletici DNA'yı bozar.
Enzimatik aktiviteyi durdurmak için bir tampon ekleyin.
Hücre agregalarını çıkarmak ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için süspansiyonu filtreleyin.
Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Hücreleri yüksek yoğunluklu gradyan ortamında yeniden askıya alın. Şimdi, daha düşük yoğunluklu bir gradyan ortamıyla kaplayın ve net bir arayüze sahip bir ayırma gradyanı oluşturun.
Katmanları ayırmak için santrifüjleyin. Bağışıklık hücreleri, gradyan ortamlar arasındaki arayüzde toplanırken, hücre kalıntıları üstte yüzer.
Daha fazla analiz için bağışıklık hücrelerini toplayın.
Bu prosedürde, temiz, tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanarak, iki yarım küreyi ikiye bölmek için beynin merkezinden sagital bir kesim yaparak tümörü içeren beyin bölgesini izole edin. İpsilateral hemisfer medial tarafını aşağı çevirin ve tümör implantını içeren hedef dokuyu izole etmek için beyincikte bir koronal kesim ve koku alma ampulünde başka bir kesim yapın.
Ardından, hedef dokuyu 1 mililitre DPBS içeren etiketli cam aşağı doku öğütücüsüne yerleştirin. Pistonu sonuna kadar aşağı itin ve dokuyu bozmak için yedi kez çevirin. Bundan sonra, sıvının doku öğütücünün dibine geri çökmesini sağlamak için pistonu kaldırın. Bu adımı üç kez tekrarlayın. Bununla birlikte, beyin dokusunun aşırı gerilmesini önlemek için pistonu sonraki iki tekrar sırasında yalnızca dört kez ve son tekrar sırasında üç kez çevirin.
Daha sonra, kalan beyin maddesini doku öğütücüye durulamak için pistonun yanlarına üç adet 1 mililitre hacimde buz gibi soğuk DPBS uygulayın. Ardından, ezilmiş beyin maddesini yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin ve buz üzerinde etiketli 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. DAPS doku öğütücünün kenarlarını 1 mililitre buz gibi soğuk DPBS ile durulayın ve aynı 15 mililitrelik santrifüj tüpüne ekleyin.
Tüm numuneler işlenene kadar ezilmiş beyin maddesi içeren tüm tüpleri buz üzerinde tutun. Daha sonra, 15 mililitrelik santrifüj tüplerinde ezilmiş beyin maddesini 740 kez g'de 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca döndürün. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve peletlenmiş beyin maddesini önceden hazırlanmış bir kollajenaz ve DNaz I sindirim enzimleri karışımının 1 mililitresinde yeniden süspanse edin.
15 mililitrelik santrifüj tüplerini bir test tüpü rafına yerleştirin ve rafı 15 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin, ardından doku ayrışmasını kolaylaştırmak için tüpleri hafifçe vurarak inkübasyon süresi boyunca numuneleri iki kez hafifçe çalkalayın.
Daha sonra, sindirim enzimlerini seyreltmek için her tüpe 6 mililitre buz gibi soğuk DPBS ekleyin. Yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin ve toplam hacmi steril 70 mikron naylon ağ filtrelerden buz üzerinde yeni etiketli 15 mililitrelik santrifüj tüplerine filtreleyin.
Daha sonra, tek hücreli bir pelet elde etmek için beyin hücresi süspansiyonunu 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca 740 kez g'de döndürün. 15 mililitrelik tüpleri santrifüjden çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Ardından, bir sonraki adıma hazırlık olarak santrifüj üzerindeki sıcaklık ayarını yaklaşık 21 santigrat dereceye yükseltin.
Daha sonra, hücre süpernatantını tamamen çıkarın ve başlangıçta hücre peletlerini bir P1000 mikropipet kullanarak 1 mililitrelik %70 yoğunluklu santrifüjleme ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, her tüpe dört mililitre daha %70 yoğunluklu santrifüj ortamı ekleyin. Kapakları güvenli bir şekilde takın ve tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu homojenize edin.
Bundan sonra, %70 yoğunluklu santrifüj ortamında yeniden süspanse edilmiş beyin hücrelerini içeren 15 mililitrelik santrifüj tüplerini buzdan oda sıcaklığında bir test tüpüne geri aktarın. Her seferinde bir tane, iki yoğunluklu santrifüj ortamı katmanı arasında temiz bir arayüz oluşturmak için 2 mililitre %37 yoğunluklu santrifüj ortamı çözeltisini 5 mililitre %70 yoğunluklu santrifüj ortamı üzerine dikkatlice yerleştirin.
Ardından, iki katman arasındaki arayüzün konumunu ince uçlu bir işaretleyici ile işaretleyin, böylece santrifüjlemeden sonra ayrım daha az belirgin hale geldiğinde kolayca tanımlanabilir. Yoğunluk santrifüj ortamı katmanları arasındaki arayüzü bozmamak için 15 mililitrelik santrifüj tüplerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 740 kez g'de döndürün.
Daha sonra, lipit tabakasını dikkatlice atlayarak, tüpe bir P200 mikropipeti sokarak iki yoğunluk santrifüj ortamı katmanı arasındaki arayüzde biriken PBMC'leri toplayın. PBMC bandı seviyesine geldikten sonra, %70 yoğunluklu santrifüjleme ortamı katmanının yüzeyinden 200 mikrolitreyi yavaşça çıkarın ve buz üzerinde sırasıyla etiketlenmiş bir polipropilen FACS tüpüne aktarın. Numune başına toplam 400 mikrolitre hacim elde etmek için bu adımı bir kez tekrarlayın.