Sıçan Serebellar Granül Nöron Kültüründen Mikroglia'nın Seçici Olarak Çıkarılması

Hasat edilmiş bir sıçan beyinciğini alın ve parçalara ayırın.

Parçaları tripsin içeren bir tüpe aktarın ve inkübe edin.

Tripsin, dokunun hücre dışı matrisini sindirerek serebellar granül nöronlarını ve ayrıca mikroglia ve astrositler gibi nöronal olmayan hücreleri gevşetir.

Bir tripsin inhibitörü ve DNaz içeren bir tampon ekleyin. İnhibitör, tripsini inaktive ederken, DNaz kirletici DNA'yı bozar.

Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Dokuyu inhibitör ve DNaz içeren bir tampon içinde yeniden süspanse edin ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için mekanik olarak ayrıştırın.

Süspansiyonu protein içeren bir tampon çözeltisi üzerine yerleştirin.

Hücresel kalıntı içeren süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Hücreleri ortamdaki yeniden süspanse edin ve hücresel bağlanmayı kolaylaştırmak için poli-L-lizin kaplı lameller üzerine tohumlayın.

Ortamı çıkarın. Hücreleri taze ortamla yıkayın ve ardından glial hücre çoğalmasını önlemek için bir hücre döngüsü inhibitörü içeren ortam ekleyin.

Ortamın yarısını bir lizozom inhibitörü içeren yeni ortamla değiştirin.

İnhibitör seçici olarak mikroglia'yı hedef alır ve lizozomal membranları bozarak mikroglial ölüme ve kültürden çıkarılmasına neden olur.

Bu prosedüre, serebellayı dört ila yedi günlük sıçan yavrularından toplayarak başlayın. Bunları hemen buz üzerinde beş mililitre A çözeltisi içeren bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, fazla çözeltiyi serebelladan çıkarın ve dokuyu Petri kabı kapağına yerleştirin. Ardından, dokuyu iyi alevlenmiş bir tıraş bıçağıyla en az üç farklı yönde ince ince doğrayın.

Daha sonra, doğranmış dokuyu çözelti B'ye ekleyin. Beş dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosuna koyun ve her iki dakikada bir hafifçe sallayın. Ardından, tripsini nötralize etmek için tüpe 20 mililitre D çözeltisi ekleyin. Çalkalayın ve 65 g'da beş dakika santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı dökün. Dört mililitre C çözeltisinde tekrar süspanse edin.

Süspansiyon mümkün olduğunca homojen olana kadar, çapı azalan üç alevli cam pipetin her biri ile numuneyi 10 kez tritüre edin. Ardından, bu homojenattan birkaç damla yavaş ve nazikçe BSA-EBSS'nin üzerine ekleyin. BSA-EBSS'den batmaya başlarsa, daha fazla ezin ve biraz daha C çözeltisi ekleyin. Homojenat, BSA-EBSS'nin üzerinde bir tabaka halinde oturmalıdır.

Beş dakika boyunca 100 g'da döndürün ve sallamayın. Ardından, süpernatanı çıkarın ve peleti bir mililitre MEM ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın ve 500 mikrolitre MEM ortamında lamel başına 800.000 hücreye yerleştirin. Bundan sonra,% 6 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, hücre döngüsü inhibitörü AraC'ın 10 mikromolar içeren bir MEM ortamı çözeltisi yapın.

Her lamel için, eski ortamın 250 mikrolitresini 24 oyuklu yeni bir plakada tutun ve geri kalanını aspire edin. Hücreleri yıkamak için 250 mikrolitre normal MEM ortamı ekleyin. Daha sonra, hücrelere 250 mikrolitre eski ortam ekleyin ve 250 mikrolitre AraC içeren ortam ile doldurun.

Bu prosedürde, 150 milimolar LME'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için beş mililitre MEM ortamına saf LME ekleyin. Asit-baz çözeltisi kullanarak çözeltiyi pH 7.4'e geri döndürün. Ardından, 0,2 mikrometre şırınga filtreli 28 milimetrelik bir PES kullanarak steril filtreleyin.

Daha sonra, LME çözeltisini MEM ortamında 50 milimolar konsantrasyona seyreltin. Ardından, kontrol kültürleri için normal MEM ortamı ile birlikte 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. 10 dakika sonra, her CGC kültüründen 250 mikrolitre MEM ortamını çıkarın. Ardından, ortamı 37 santigrat derecede tutun.

Daha sonra, hücreleri iki kez LME içeren MEM ortamı ile veya kontrol kültürleri için LME içermeyen önceden ısıtılmış MEM ortamı ile tedavi edin. Hücreleri 37 santigrat derecede% 6 karbondioksit ile nemlendirilmiş bir atmosferde bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, LME içeren ortamı çıkarmak için hücreleri önceden ısıtılmış taze MEM ortamında iki kez yıkayın.

Ardından, tutulan kültür ortamını eşit miktarda taze önceden ısıtılmış MEM ortamı ile değiştirin. Son olarak, kültürleri 37 santigrat derecede% 6 nemlendirilmiş karbondioksit içinde inkübe edin.