Sıçan Beyninden Elde Edilen Glial Hücrelerin Üç Boyutlu Bir Kültürünün Oluşturulması

Bir sıçan beyninden türetilen yapışık bir glial hücre kültürüne sahip bir mikroplaka alın. Kültür, astrositler, mikroglia ve oligodendrositler içerir.

Ortamı çıkarın, hücreleri ayırmak için bir enzim çözeltisi ile inkübe edin ve ardından bunları bir tüpe aktarın.

Süpernatanı hücresel kalıntılarla santrifüjleyin ve çıkarın. Hücreleri ılık bir ortamda yeniden askıya alın.

Hücre kümelerini parçalamak için bir şırınga kullanarak ezin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için bir süzgeç kullanarak süzün.

Fotoçapraz bağlanabilir bir biyopolimer, çapraz bağlama maddeleri ve hücre dışı matris bileşenleri ekleyin.

Karışımı bir lamel üzerine tutturulmuş bir kalıba dökün. Çapraz bağlanmayı indüklemek, bir jel oluşturmak ve glial hücreleri kapsüllemek için karışımı yüksek yoğunluklu ışığa maruz bırakın.

Kalıbı çıkarın ve lamelleri bir mikroplakaya yerleştirin. Sıcak bir ortam ekleyin ve jeli fizyolojik koşullar altında inkübe edin.

Hücreler, destekleyici hücre dışı matris içinde çoğalır ve üç boyutlu bir glial hücre kültürü oluşturarak hücresel bir ağ oluşturur.

Hücre kapsüllenmesinden 24 saat önce, ortamı iki haftalık birincil kültürlerden aspire edin ve her oyuğa 1 mililitre taze ortam ekleyin. Hücre kapsülleme gününde, her 12 oyuklu plaka için 12.5 mililitre seyreltik tripsin ve 25 mililitre ortam hazırlayın ve bir su banyosunda 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ardından, 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 1 mililitre seyreltilmiş tripsin eklemek için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın.

Birleşen hücre tabakası plakadan ayrılana kadar 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tek bir yüzen parça olarak görünmesi gereken ayrılmış hücreleri geri kazanmak için 1 mililitrelik bir pipet kullanın ve 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Eşdeğer bir hacimde ortam ile seyreltin ve oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin.

Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı atın ve hücre peletini 10 mililitre ılık ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri pipetle beş kez ezin, ardından iki dakika boyunca 200 kez g'de tekrar santrifüjleyin. Döndürmeden sonra, süpernatanı boşaltın, hücreleri 5 mililitre ılık ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın.

Daha sonra, 18 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, hücre çözeltisini üç kez tritüre edin ve süspansiyonu 40 mikronluk bir hücre süzgecinden yeni bir konik santrifüj tüpüne süzün. Daha sonra, 10 mikrolitre hücre süspansiyonu toplayın ve ılık ortamda 1'e 100 oranında seyreltin ve hücreleri otomatik bir hücre sayacı ile sayın.

Kalan hücreleri, kapsülleme adımına kadar 37 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe edin. Her bitki için 12,5 mililitre saf ortam ve 12,5 mililitre şartlandırılmış ortam ısıtın: 12 oyuklu 3D hidrojel plakası. Daha sonra, bitki 12 oyuklu plaka başına 7 miligram HAMA tartın ve hacim için ağırlık% 2'lik bir konsantrasyon için steril filtrelenmiş olarak ekleyin. HAMA tamamen çözülene kadar çözeltiyi 20 kilohertz'de 60 dakika boyunca sonikleştirin.

Sonikasyon yaparken, hem TEA hem de NVP'nin bireysel% 10'luk çözeltilerini hazırlayın. Ayrıca steril PBS'nin 1 mililitrelik alikotlarında 1 milimolar bir eozin çözeltisi hazırlayın. Daha sonra, her 12 oyuklu plaka için, 1 x 10⁷ hücreli, %0.5 HAMA, PBS'de %20 bazal lamina karışımı, %0.1 TEA, %0.1 NVP ve 0.01 milimolar eozin Y'den oluşan son 1.4 1.4 mililitre karışımı yapın.

Çözeltiyi nazikçe karıştırdıktan sonra, her bir PDMS kalıbına 100 mikrolitre dağıtmak için 1 mililitre uçlu bir pipet kullanın. Ardından, numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kapalı bir kutuda yüksek yoğunluklu yeşil LED ışığa maruz bırakın.

Beş dakikalık yeşil LED pozlaması, 3D jeli oluşturmak için çok önemlidir. Eozin Y tarafından verilen kırmızı renk şeffaf hale gelecek ve reaksiyonun sona erdiğini gösterecektir.

Daha sonra, 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mililitre ılık, şartlandırılmış ortam ekleyin; Her bir lamel başparmak ve işaret parmağı arasında kavrayın ve jeli yerinden çıkarmadan PDMS kalıbını yavaşça soymak için kavisli cımbız kullanın. Kalıbı şartlandırılmış bir ortama sahip bir kuyuya yerleştirin.

Kalıbı çıkarmak en zorlu adımdır. Jelinin yerinden çıkmasını ve lamellerin kırılmasını önlemek için azami özen gösterilmelidir. Bu pratik yapabilir.

Tüm kalıplar plakanın kuyucuklarına aktarıldıktan sonra, her oyuğa ilave 1 mililitre ılık DMEM / F12 ortamı ekleyin. Görüntülemeden önce plakaları iki hafta boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.