JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:16 dk. • July 8th, 2025
Hücre dışı bir matris veya ECM ile kaplanmış çok kuyulu bir plaka alın.
Ayrı kuyucuklara, bir kültür ortamında transgenik olmayan ve transgenik insan pluripotent kök hücrelerini veya hPSC'leri ekleyin.
Transgenik hPSC'ler, antibiyotikle indüklenebilen bir promotör altında bir transgen taşır. Transgen, nöral farklılaşmayı indükleyen bir transkripsiyon faktörünü kodlar.
ECM'ye hücre yapışmasını kolaylaştırmak için inkübe edin. Ortamdaki küçük moleküller apoptozu önleyerek hücre çoğalmasını teşvik eder.
Hücreleri ayırmak için bir ayırma çözeltisi ekleyin; ayrışmayı durdurmak için ortamı ekleyin ve daha sonra hücre çoğalmasına izin vermek için bunları başka bir ECM kaplı mikroplakaya aktarın.
Transgenik olmayan hücrelere küçük moleküller içeren bir nöral farklılaşma ortamı ve transgenik hücrelere indükleyici antibiyotik ekleyin.
Küçük moleküller, transgenik olmayan hücrelerin nöral progenitör hücrelere veya NPC'lere farklılaşmasını sağlar. Transgenik hücrelerde, transkripsiyon faktörünün antibiyotik kaynaklı ekspresyonu, NPC'lere farklılaşma için gerekli genleri aktive eder.
Aşağı akış uygulamaları için NPC'leri kültürde tutun.
Transgenik olmayan nöronal progenitörlerin ve nöronların veya hNeuronların üretilmesi için, 14. gün hPSC'den türetilmiş nöral progenitörleri, oyuk başına 2 mililitre nöral ortam ve Y27632 ile ECM kaplı altı oyuklu plakalara bakın.
Doksisiklin ile indüklenebilen iNeuronlarla çalışıyorsanız, farklılaşmayı indüklemek ve gen ekspresyonunu aktive etmek için hücreler yaklaşık% 35 birleştiğinde doksisiklin içeren nöral ortam ekleyin. İki gün sonra, transgenik ve transgenik olmayan hatları günde 2 mililitre nöral medya ile besleyin. Hücreler% 70 birleşmede kalkmaya hazır olana kadar devam edin.