Hidrojel Mikro Sütunlar İçinde Astrosit İskeleleri Oluşturmak için In Vitro Bir Yöntem

Tanımlanmış çapta içi boş tüplerden oluşan bir mikro sütun teknesi içeren bir kültür kabı alın.

Bir hidrojelden yapılan mikro sütunlar, kurumayı önlemek için bir tampon ile doldurulur.

Bir stereomikroskop altında, tamponu çıkarın ve hücre dışı matrisin bir bileşeni olan buz gibi soğuk bir kollajen çözeltisi ekleyin.

Kolon hidrasyonunu korumak için yemeğin iç kenarı boyunca bir ortam yerleştirin. Kollajenin polimerize olması için fizyolojik koşullar altında inkübe edin ve mikro sütunların içinde bir kaplama oluşturun.

Mikro sütunların içine astrositler ekleyin ve astrositin kollajene yapışmasını teşvik etmek için inkübe edin.

Daha sonra, çanağı ortamla doldurun ve fizyolojik koşullar altında tutun.

Mikro sütunların dar çapı nedeniyle, astrositler, uzunluk boyunca uzanan süreçlerle iki kutuplu bir morfoloji kazanır.

Zamanla, astrositler, yoğun astrosit süreçleri demetleri içeren üç boyutlu bir iskele oluşturmak için kendi kendine birleşir.

Hidrojel kaplı astrosit iskelesi, aşağı akış tahlilleri için hazırdır.

Bir biyogüvenlik kabininin içinde, ko-kültür ortamında mililitre başına 1 miligram sıçan kuyruğu tip I kollajen çözeltisi hazırlayın ve ardından buzun üzerine yerleştirin. ECM çözeltisinin pH'ını, pH 7,2 ila 7,4 aralığında stabil olana kadar gerektiği gibi asit veya baz ile ayarlayın. Mikro sütun teknesini forsepsli 35 veya 60 mililitrelik bir Petri kabına aktarın. Rehberlik için stereoskopu kullanarak, bir mikropipetin 10 mikrolitrelik ucunu her bir mikrosütunun bir ucuna yerleştirin ve DPBS ve hava kabarcıklarının lümenini boşaltmak için emdirin.

Kollajen solüsyonu ile bir P10 mikropipeti şarj edin. 10 mikrolitrelik ucu her bir mikro sütunun bir ucuna yerleştirin ve lümeni doldurmak için yeterli çözelti verin, ardından mikro sütunun her iki ucuna bir ECM rezervuarı pipetleyin. Tüm sütunlar doldurulduktan sonra, sütunların kurumasını önlemek için ko-kültür ortamını Petri kabının etrafına bir halka halinde pipetleyin.

Hücreleri eklemeden önce kollajenin polimerizasyonunu teşvik etmek için mikro kolonları içeren kabı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte en az bir saat inkübe edin. Daha sonra, bir P10 mikropipetinin ucunu bir mikro sütunun bir ucuna yerleştirin ve doldurmak için yaklaşık 5 mikrolitre hücre solüsyonunu lümene aktarın. Tüm mikro sütunları bir tekneye ektikten sonra, astrositlerin ECM'ye bağlanmasını teşvik etmek için bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Kuluçka döneminden sonra, tohumlanmış mikro sütunları içeren tabakları, sırasıyla 35 veya 60 milimetre Petri kapları için 3 veya 6 mililitre ko-kültür ortamı ile dikkatlice doldurun. 6 ila 10 saat sonra demetlenmiş kablo benzeri bir yapı oluşturması gereken hizalanmış astrositik demetlerin kendi kendine montajını teşvik etmek için kaplanmış mikro sütunları kültürde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutun.