İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Türetilen Farklılaşmış Nöronların Yeniden Kaplanması

Yoğun bir nöronal ağa sahip insan pluripotent kök hücre türevli farklılaşmış nöronları içeren büyük bir kültür plakası ile başlayın.

Bu nöronları hafif proteolitik enzimlerle inkübe ederek plakadan ayırın ve bir tabaka olarak kaldırın.

Devam eden inkübasyon ile enzimler hücre bağlantılarını kısmen bozarak nöronal ağları gevşetir.

Enzim aktivitesini durdurmak için bir kültür ortamı ekleyin.

Ayrılan nöronları birbirinden ayırmak için tekrar tekrar pipetleyin.

Hücre kümelerini çıkarmak ve tek tek nöronları toplamak için nöronları bir hücre süzgecinden süzün.

Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın. Onları bir büyüme ortamında yeniden askıya alın.

Yeniden kaplama için, bu nöronları bir polimer ve yapışma proteini kaplı çok kuyulu bir plaka üzerine tohumlayın. Bağlanmalarına izin vermek için kuluçkaya yatırın.

Nöronlar, canlı kalabilmek için ortamdaki besinleri kullanır. Besin seviyelerini korumak için kültür ortamını düzenli olarak değiştirin.

Nöronal olgunlaşmaya ve aralarında bağlantı kurulmasına izin vermek için daha fazla kuluçkaya yatırın.

Farklılaşmış nöronların plakasını PBS ile nazikçe durulayarak başlayın. PBS'yi plakanın duvarından aşağı doğru dağıtın ve onları bozmamak için doğrudan hücrelerin üzerine değil. PBS'yi devirirken tabağın kenarından aspire edin ve hücrelere dokunmamaya dikkat edin.

10 santimetrelik plaka başına en az 1 mililitre proteolitik enzim uygulayın ve hücreleri 40 ila 45 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Kuluçka sırasında, nöronları bir faz kontrast mikroskobunda kontrol edin ve sinir ağı plakadan tamamen ayrılana ve parçalanmaya başlayana kadar proteaz tedavisine devam edin. Nöronlar ayrıldığında, her 1 mililitre proteaz için 5 mililitre taze DMEM ortamı ekleyerek sindirimi durdurun.

Hücreleri plakaya 5 ila 8 kez nazikçe ezmek için serolojik bir pipet kullanın ve çok fazla baskı uygulamadığınızdan emin olun. Hücreleri 100 mikrometrelik bir ağdan 50 mililitrelik konik bir tüpe damla damla süzün ve süzgeci ek 5 mililitre taze DMEM ortamı ile durulayın.

Hücreleri 5 dakika boyunca 1.000 kez g'de döndürmek için bir tezgah üstü santrifüj kullanın. Santrifüjlemeden sonra, konik tüpü biyogüvenlik kabinine geri koyun ve ortamın çoğunu aspire edin, hücreleri nemli tutmak için 250 mikrolitre bırakın. Hücreleri 2 mililitre taze DMEM ortamında nazikçe yeniden süspanse edin ve bunları 5 mililitrelik bir serolojik pipetin ucundan geçirin.

Son olarak, tüpü 2 ila üç kez ters çevirin. Canlı hücreleri saymak için bir hemositometre ve tripan mavisi kullanın ve ardından hücreleri taze DMEM ile istenen konsantrasyona seyreltin. Spesifik hücre hattının gereksinimlerine bağlı olarak tüpe uygun takviyeler ekleyin ve konik tüpü 2 ila 3 kez eğerek hücreleri nazikçe karıştırın.

Laminin kaplamayı 24 oyuklu bir plakadan aspire edin ve PBS ile bir kez durulayın. PBS'yi aspire edin ve topaklanmayı önlemek için her bir oyuğa sekiz şeklinde bir hareketle hücre çözeltisi uygulayın. Hücreleri kaplamayı bitirdiğinizde, plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak ayarlanmış inkübatöre geri koyun.