Mikroakışkan Çip Kullanarak İnsan iPSC'den Türetilmiş Motor Sinir Organoidlerinin Geliştirilmesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri veya iPSC'leri, Rho-kinaz inhibitörleri ile besin açısından zengin bir kök hücre ortamında alın.

İnhibitörler hücrelere girer ve Rho-kinaz enzimlerini bloke ederek apoptotik hücre ölümünü önler.

Hücreler, çoğalmak için besinleri kullanır ve sferoid adı verilen üç boyutlu bir hücre kümesi oluşturmak için kendiliğinden toplanır.

Yavaş yavaş, ortamı bir nöral indüksiyon ortamı ile değiştirin. Ortamdan gelen sinyal modülatörleri, kök hücrelerin nöral hücrelere farklılaşmasını sağlar.

Küresel hücreleri motor nöronlara ayırmak ve bir motor nöron sferoidi veya MNS oluşturmak için büyüme faktörü açısından zengin bir nöral ortamla değiştirin.

Bu MNS'leri bir olgunlaşma ortamı içeren polimer kaplı bir mikroakışkan çipe aktarın.

Ortamdaki sinir büyüme faktörleri, aksonları veya nöronların daha uzun projeksiyonlarını sferoidden büyümeye ve çipin mikro kanalından geçmeye teşvik eder.

Bu, motor sinir dokusunun üç boyutlu bir modeli olan bir motor sinir organoidi oluşturur.

Motor nöronlara 3D iPS hücre farklılaşmasını indüklemek için, 10 mikrolitre besleyici ve 10 mikromolar Y27632 ile desteklenmiş serumsuz hücre kültürü ortamında 96 oyuklu bir U-alt plakanın uygun sayıda oyuğuna kuyu başına 4 x^{10 4} iPS hücresi tohumlayın.

Ertesi gün, her bir oyuktaki süpernatanı, 10 mikromolar SB-431542 ve 100 nanomolar LDN-193189 ile desteklenmiş 100 mikrolitre KSR ortamı ile değiştirin. 2. ve 3. günlerde, süpernatanları 10 mikromolar SB-431542, 100 nanomolar LDN-193189, 5 mikromolar DAPT, 5 mikromolar SU-5402, 1 mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar düzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş 100 mikrolitre KSR ortamı ile değiştirin. 4. ve 5. günlerde, süpernatantları 10 mikromolar SP-431542, 100 nanomolar LDN-193189, 5 mikromolar DAPT, 5 mikromolar SU-5402, 1 mikromolar retinoik asit ve 1 mikromolar düzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş KSR ortamının% 75'i ve N2 ortamının% 25'i karışımıyla değiştirin.

6. ve 7. günlerde, süpernatantları% 50 KSR ortamının ve% 50 N2 ortamının bir karışımıyla değiştirin, 5 mikromolar DAPT, 5 mikromolar SU-5402, 1 mikromolar retinoik asit ve 1 mikromolar pürüzsüzleştirilmiş agonist ile desteklenmiştir. 8. ve 9. günlerde, süpernatantları 5 mikromolar DAPT, 5 mikromolar SU-5402, 1 mikromolar retinoik asit ve 1 mikromolar yumuşatılmış agonist ile desteklenmiş% 25 KSR ortamının% 75'i ve N2 ortamının% 1'i karışımıyla değiştirin. 10. ve 11. günlerde, süpernatanları 5 mikromolar DAPT, 5 mikromolar SU-5402, 1 mikromolar retinoik asit ve 1 mikromolar düzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş N2 ortamı ile değiştirin. 12. günde, her bir oyuktaki süpernatantları, kuyucuk başına mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre olgunlaşma ortamı ile değiştirin.

Motor sinir organoid oluşumunu indüklemek için, PDMS çipindeki kaplama solüsyonunu, mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ile desteklenmiş 150 mikrolitre olgunlaşma ortamı ile değiştirin ve geniş delikli bir mikropipet ucu kullanın motor nöron sferoidlerini 96 oyuklu plakanın bir oyuğundan çipin mikrokanalının girişine nazikçe ekleyin. Orta buharlaşmayı önlemek için tabağın içindeki doku kültürü çipinin yanına küçük bir steril su rezervuarı yerleştirin ve tabağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

Her iki ila üç günde bir, tükenmiş kültür ortamının yarısını, orta rezervuarın merkezinden, mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ile desteklenmiş taze olgunlaşma ortamı ile değiştirin. Aksonlar, motor nöron sferoidinden kanala doğru büyüyecek ve bir motor sinir organoidi oluşturmak için iki ila üç haftalık bir süre boyunca kendiliğinden tek bir demet halinde toplanacaktır.