JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 2:35 dk • July 8th, 2025
Gen susturmada rol oynayan bir RNA türü olan küçük enterferans yapan RNA'yı veya siRNA'yı ele alalım.
Lipozom adı verilen küresel lipid vezikülleri ekleyin.
Lipozom, siRNA'yı kapsülleyerek onu bozulmaya karşı korur.
Nöral kök hücreler içeren bir kültür kuyusuna siRNA-lipozom kompleksleri ekleyin. Birini kontrol olarak iyi tutun ve kuluçkaya yatırın.
Lipozom, hücre zarı ile birleşerek siRNA'yı serbest bırakır.
siRNA, bir ipliğin çıkarıldığı RNA kaynaklı susturma kompleksine veya RISC'ye bağlanır.
Kalan iplikçik, hücre farklılaşmasından sorumlu mRNA'yı hedef alarak bozulmasına yol açar.
Kuyucuklara uygun bir farklılaşma ortamı ekleyin.
Kontrol kuyusunda, ortamdaki büyüme faktörleri ve diğer besinler, nöral kök hücrelerin osteoblastlara farklılaşmasını teşvik eder.
Uygun boyama tekniklerini kullanarak, hücreler üzerinde osteoblasta özgü belirteçleri boyayın ve çekirdeği mavi bir floresan boya ile boyayın.
Gen susturulmuş hücrelerde osteoblasta özgü belirteçlerin olmaması, farklılaşamadıklarını gösterir.
O9-1 hücrelerinde siRNA yıkımı gerçekleştirmek için hücreleri geri kazanır ve tohumlar. Lipozomları uygun hacimde serum içermeyen ortamda seyreltin. Ardından, siRNA'yı metin protokolüne göre serumsuz ortamda seyreltin. Bundan sonra, seyreltilmiş siRNA'yı üreticinin talimatlarına göre seyreltilmiş lipozomlara ekleyin. Çözeltiyi pipetleyerek karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
Daha sonra, hücrelere uygun hacimde siRNA-lipid kompleksi ekleyin. Daha sonra, hücreleri standart bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat inkübe edin. O9-1 hücreleri, spesifik farklılaşma kültürü koşulları altında farklı hücre tiplerine farklılaşabilir. O9-1 hücrelerini osteoblastlara farklılaştırmak için, metin protokolüne göre osteojenik farklılaşma ortamı hazırlayın. Son olarak, immün boyama ile farklılaşmış osteoblastlarda osteoblast belirteci osteokalsini tespit edin.