JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 2:38 dk. • July 8th, 2025
Laminin kaplı çok kuyucuklu bir plakada yetişkin insan fibroblastlarından türetilen indüklenmiş nöral progenitör hücre kolonilerinin yapışık bir kültürü ile başlayın.
Yapışmayan hücreleri çıkarmak için kolonileri bir tamponla yıkayın, ardından taze tampon ekleyin.
Çevreleyen hücreleri çıkarmak için tek tek kolonilerin etrafını kazıyın.
Kolonileri nöroindüksiyon ortamı içeren taze laminin kaplı kuyucuklara aktarın.
Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için kolonileri mekanik olarak ayırın.
Hücre dışı bir matriks proteini olan laminin, progenitörlerin yüzey proteinleri ile etkileşime girerek hücrenin kuyu yüzeyine yapışmasını kolaylaştırır.
Hücrelere giren ve spesifik protein kinazları bloke ederek hücresel apoptozu önleyen küçük bir molekül inhibitörü ekleyin.
Nöroindüksiyon ortamında bulunan büyüme faktörleri ve küçük moleküller, progenitörlerin çoğalmasını kolaylaştırır.
Besinleri yenilemek için ortamı periyodik olarak değiştirin ve sürekli progenitör proliferasyonunu kolaylaştırın.
Birleştirilmiş bir kültür veya tamamen kaplanmış bir hücre tabakası, indüklenmiş nöral progenitör hücrelerin başarılı bir şekilde genişlediğini gösterir.
Bir gün sonra, plakalardan laminini aspire edin ve kuyucuklara 200 mikrolitre nöral indüksiyon ortamı ekleyin. Altı oyuklu bir plakanın oyuğu başına 2 mililitre nöral indüksiyon ortamı eklemeden önce, toplanacak kolonileri içeren altı oyuklu plakaları bir kez DPBS ile yıkayın.
Çevredeki hücrelerden kurtulmak için ince bir iğne kullanarak kolonilerin etrafını kazıyarak ve 50 mikrolitrelik 200 mikrolitrelik bir pipet adamına monte edilmiş pipet uçlarını kullanarak kolonileri toplayarak hücreleri mekanik olarak toplayın.
Her koloniyi laminin kaplı 48 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın ve 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak tek hücreli bir süspansiyon oluşturun. Hücrelere 10 mikromolar final konsantrasyonunda Rho-kinaz inhibitörü ekleyin. 48 oyuklu plakadaki hücreleri iki gün boyunca 37 santigrat derece,% 5 CO2'de büyütün. Hücreler %80 ila %90 birleşime ulaşana kadar ortamı her iki günde bir değiştirin.