Kemirgen beyin dilimlerinin uzun süreli kültürü için modifiye edilmiş bir silindir tüp yöntemi

Bir kemirgen beyninden elde edilen beyin dilimlerini alın. Dilimler, hipokampal nöronları içeren hipokampustan oluşur.

Beyin dilimlerini tavuk plazması içeren lamellere aktarın.

Dilimlere trombin ile karıştırılmış plazma uygulayın. Trombin, plazma pıhtılaşmasını indükleyerek dilimlerin lamellere yapışmasını destekleyen biyolojik bir iskele oluşturur.

Düz tarafında bir delik bulunan düz kenarlı makaralı tüpler ve tüplerin dışındaki deliğin etrafına bağlı bir yapışkan disk alın.

Lamelleri yapışkan disklerin üzerine yerleştirin ve beyin dilimlerinin tüplerin iç kısmına baktığından emin olun.

Tüplere bir nöronal kültür ortamı ekleyin ve bir karbondioksit ve hava karışımı içinde akıtın.

Tüpleri kapatın, bir makaralı rafa yerleştirin ve yuvarlanma hareketiyle inkübe edin.

Yuvarlanan inkübasyon tarafından sağlanan havalandırma ve ortamın besinleri, beyin dilimlerinin uzun süreli kültürlenmesini destekler.

Başlamak için, makaralı boru rafını hazırlayın ve ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi makaralı borularda bir delik açmaya yardımcı olacak bir aparat yapın. Jig'i kullanarak, düz kenarlı 1 santimetrelik plastik kültür tüpünü düz tarafı yukarı bakacak şekilde yerinde tutun. Ardından, merkezi alttan 1 santimetre uzakta ve tüpün kenarları arasında ortalanmış olarak 6 milimetre çapında bir delik açın.

Döner çapak alma aleti ile deliğin kenarlarını düzleştirin ve dönüş sırasında deliğin boşaltılmasını kolaylaştırmak için deliğin iç kenarında dört oluk açın. Daha sonra, tüpleri %70 etanol ile durulayın ve ardından biyolojik bir güvenlik kabininde havayla kurutun. Tüpleri UV lambası altında 40 dakika boyunca 12 milimetre delikli yapışkan silikon kauçuk disklerde sterilize edin.

20 dakika sonra, tüpleri ve diskleri, açıkta kalan tüm yüzeyler sterilize edilecek şekilde yeniden konumlandırın. Ardından, yapışkan diskin beyaz desteğini soyun. Delikleri hizalayın ve silikon kauçuğu tüpün dışına sabitleyin.

Dilimler elde edildikten sonra, hazırlanan bir lamel ile oyulmuş tarafın ortasına 2 mikrolitre tavuk plazması yerleştirin. 3 ila 4 milimetre çapında bir nokta elde etmek için plazmayı hafifçe yayın. Ardından, hazırlanmış bir beyin dilimini kaldırmak için steril, dar uçlu bir spatula kullanın. Dilimi kaldırırken dilimi spatula ucunda tutmak için kapalı forseps kullanın. Spatulayı lamel üzerindeki plazma noktasına dokundurun ve kapalı forseps ile dilimi lamel üzerine itin.

Dilimi yerleştirmeden önce lamel üzerine ince bir civciv plazma tabakası ve dilimi kaplamak için minimum miktarda trombin ile muamele edilmiş plazma ekleyin. Dilim yüzerse, pıhtı çıkarıldığında yapışık kalmayacaktır.

Daha sonra, 2.5 mikrolitre plazma ve 2.5 mikrolitre trombini ayrı bir tüpte karıştırın. Bu karışımdan 2,5 mikrolitreyi dilimin üzerine ve çevresine hızlıca yerleştirin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha önce silindir tüpüne yapıştırılmış olan silikon kauçuk yapıştırıcının açıkta kalan tarafındaki şeffaf plastik kaplamayı çıkarın. Ardından, lameli beyin dilimi ile birlikte yapıştırıcının üzerine yerleştirin ve dilimi deliğin içinde hizalayın.

Yapışmayı sağlamak için, lameli eşit şekilde aşağı bastırarak ve biyolojik güvenlik kabinine aktarırken yaklaşık 1 dakika tutarak lamel üzerine başparmağınızla yumuşak eşit basınç uygulayın.

Lamelin sızıntı yapmadan boruya yapışması için üzerindeki basınç, sızdırmazlık maddesindeki hava kanallarını ortadan kaldıracak kadar doğru olmalı ve yeterince uzun süre muhafaza edilmelidir. Çok fazla basınç lameli çatlatacaktır.

Biyolojik bir güvenlik kabininde, her tüpe 0.8 mililitre tam nörobazal A kültür ortamı ekleyin. Ardından, %5 karbondioksit, %95 hava karışımını bir kelepçe ile güvenli bir şekilde tutulan steril bir pamuk tıkalı mera pipetinden akıtın. Silindir tüpünü gaz karışımıyla yıkamak ve pipetin etrafından çekilirken tüpü hızlı bir şekilde kapatmak için bunu kullanın.

Ardından, tüpleri dilim numarası ve raf numarası ile etiketleyin. Tüpleri geometrik olarak dengeli olduklarından emin olarak bir makaralı rafa yerleştirin. Tek sayıda tüp varsa, dengelemek için boş tüpler ekleyin.

Rafları 35 santigrat derece silindirli bir inkübatöre yerleştirin ve silindirler, ortamı tüplerin dibinde tutmak için silindir rafını döndürün. Ön tarafını bir tahtanın üzerine kaldırarak inkübatörü yaklaşık 5 derece geriye doğru eğin.