Hızlı Nörit Ekstansiyonu ve Fonksiyonel Nöronal Bağlantıların Oluşumunun Başlatılması

Lizin ile kaplanmış bir tabak içinde mikrokanallar içeren bir mikroakışkan cihazı monte ederek başlayın.

Embriyonik nöronları bir büyüme ortamı ile mikroakışkan kuyulara tohumlayın ve mikrokanallardan akmalarına izin verin.

Nöronal bağlanmayı ve büyümeyi kolaylaştırmak için kuluçkaya yatırın, fiziksel olarak izole edilmiş nöronal popülasyonlar oluşturun.

Kurulumu sökün ve hücre canlılığını korumak için çanağı tuzlu su akışı olan bir mikromanipülatör odasına yerleştirin.

Nöronların yakınına lizin kaplı boncuklar yerleştirin, bu da nöritlerin veya hücre projeksiyonlarının boncuk-nörit kompleksleri bağlamasını ve oluşturmasını sağlar.

Bir mikromanipülatör kullanarak, bir kanaldan bir boncuk-nörit kompleksini devreye sokmak için emme uygulayın.

Mekanik gerilimi indüklemek için bu kompleksi çekin ve hızlı nörit uzamasına yol açın.

Bunu başka bir boncuk-nöron kompleksine yönlendirin ve ikinci bir mikromanipülatör ile tutun.

Nöritik bir bağlantının oluşumunu kolaylaştırmak için her iki boncuğu da yerinde tutun.

Emmeyi serbest bırakın ve salini bir kültür ortamı ile değiştirin.

Nöronlar arasında işlevsel bağlantılar kurmak için kuluçkaya yatırın, nörotransmiterler aracılığıyla iletişimi teşvik edin.

Kuyuları boşaltmadan ortamı mikroakışkan cihazların üst kuyularından çıkarın. Daha sonra, mikroakışkan cihazın sağ üst kuyusuna 20 mikrolitre konsantre hücre çözeltisi ekleyin ve mikroskopta hücrelerin tek popülasyonlu mikroakışkan cihaz içinde nasıl aktığını kontrol edin.

Birden fazla popülasyonun cihazındaki hücreleri plakalamak için, üst kuyucukların her birine 20 mikrolitre konsantre hücre çözeltisi ekleyin. Mikroskop altında, hücrelerin odaların içinde olup olmadığını kontrol edin. Daha sonra, alt tabakaya hücre bağlanmasını teşvik etmek için cihazları 15 ila 30 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin.

Hücreler substrata bağlandıktan sonra, tek popülasyon cihazının üst iki kuyusuna 40 mikrolitre NBM ekleyin. Bu, mikro kanallardan hava kabarcıklarının çıkarılmasına yardımcı olacaktır. Çoklu popülasyon cihazının üst kuyularına, hücrelerin enjekte edildiği aynı kuyucuklara 20 mikrolitre NBM ekleyin. Medya, pozitif bir menisküs oluşturmak için hafifçe çıkıntı yapmalı ve kuyucuklara çörek üstü bir görünüm vermelidir.

Mikroakışkan cihazların çıkarılmasından bir ila iki gün önce, her numune kabına 2 mililitre önceden ısıtılmış NBM ekleyin ve odaları doldurun. Ardından, cihazları inkübatörde tutun. Daha sonra, mikroakışkan cihazları lamellerden çıkarmak için steril cımbız ve bir pipet ucu kullanın ve desenli bir nöron konfigürasyonu bırakın.

Bu prosedürde, hazırlanan PDL kaplı boncuklardan 40 ila 60 mikrolitre hücre kültürüne ekleyin. Ardından, sinaptik temasların oluşumunu teşvik etmek için numuneyi bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. Daha sonra, numuneyi, hücrelerin iki mikropipet ile yukarıdan değerlendirilebileceği ve ayrıca optik olarak erişilebileceği şekilde bir deney düzeneğine yerleştirin. Bu konfigürasyonda, görüntü yakalama için mikroskobun yan portunda bir CCD kamera bulunur. Tuzlu su ile doldurulmuş her pipeti 1 mililitrelik bir şırıngaya bağlayın. Daha sonra numuneyi fizyolojik tuzlu su çözeltisi ile perfüze edin.

Daha sonra, mikroskop altında, iki popülasyonun doğal olarak bağlantılı olmadığından emin olmak için izole edilmiş iki nöronal popülasyon arasındaki boşluğu kontrol edin. Görüş alanındaki nörona bağlı olmayan bir PDL boncuğu seçin. Boncuğa ve ardından mikropipete odaklanarak boncuğu bir mikropipet ucuyla hizalayın.

Daha sonra, mikroskopta izleyerek ucu boncuğa mümkün olduğunca yaklaştırın. Ardından, boncuğu almak için pipete negatif basınç uygulayın ve deney boyunca negatif basıncı koruyun.

Şimdi, görüş alanındaki bir nörona bağlı bir PDL boncuğu seçin ve emme kullanarak ikinci mikropipete takın. Mikromanipülatörü veya numune aşamasını 1 mikrometre için dakikada 0,5 mikrometre hızla yavaşça hareket ettirerek PDL boncuk-nöron kompleksini çekin ve nörit başlamasına izin vermek için beş dakika bekleyin.

PDL boncuk-nöron kompleksini, 2 mikrometre üzerinde dakikada 0,5 mikrometre hızla yavaşça yanal olarak hareket ettirerek çekin. Ardından, nörit uzamasına izin vermek için beş dakika bekleyin. İlk 5 mikrometre için başarılı başlatma ve nörit uzatma işleminden sonra, nöriti sürekli olarak dakikada 20 mikrometre hızla çekin.

Nöronları bağlamak için nörit açısından zengin bir bölge seçin. Lamelin üzerindeki pipet ucu yüksekliğini ölçmek için diğer boncukları kullanın ve PDL boncuk-nörit kompleksini nöritlerle fiziksel olarak temas edecek şekilde indirin. İkinci mikropipeti manipüle ederken PDL boncuk-nörit kompleksini hedef nörit ile temas halinde bırakın. Ardından, ikinci PDL boncuğu ile ikinci pipeti, yeni oluşturulan nöritin üzerine birinci boncuktan yaklaşık 20 mikrometre uzağa indirin ve yeni nörit filamentini hedef hücreye doğru itmek için ikinci PDL boncuğunu kullanın.

Ardından, her iki boncuğu da en az bir saat yerinde tutun. Mikroskopla boncuğa temas eden nöritlerin kalınlaşması olan fokal şişmenin olmadığını doğrulayın. Bu süre zarfında, numunenin ortamını fizyolojik salinden önceden ısıtılmış karbondioksit dengelenmiş NBM'ye yavaşça değiştirin.

Emmeyi serbest bırakarak boncuğu ikinci pipetten serbest bırakın. Yeni nörit takılı kalırsa, ilk hızı da bırakın. Daha sonra, gelecekteki deneyler için nöronal bağlantıyı güçlendirmek için numuneyi dikkatlice inkübatöre geri yerleştirin.