İnsan Glioblastoma Dokusundan Dilim Kültürlerinin Oluşturulması ve Sürdürülmesi

Glial hücrelerden kaynaklanan birincil bir beyin tümörü olan insan glioblastoma dokusunu ele alalım.

Kalan kanı çıkarmak için dokuyu buz gibi soğuk bir işlem ortamı kullanarak yıkayın.

Dokuyu parçalara ayırın ve erimiş agaroz içeren bir gömme kalıba yerleştirin.

Kalıbı soğutun, agarozun polimerize olmasına ve stabil bir jel matrisi oluşturmasına izin verin.

Doku bloğunu kalıptan çıkarın ve bir vibratomun numune plakasına sabitleyin.

Bloğu daldırmak için buz gibi soğuk işleme ortamını ekleyin. Doku canlılığını koruyarak ortamı havalandırmak için oksijenli bir gaz karışımından geçirin.

Gömülü tümör dokusunu ince dilimler halinde bölümlere ayırın.

Doku mimarisini korumak için buz gibi soğuk işleme ortamını içeren bir petri kabına bir dilim aktarın.

Daha sonra, doku dilimini, bir dilim kültürü bakım ortamı içeren bir kuyucukta geçirgen bir zar eki üzerine yerleştirin.

Dilimi fizyolojik koşullarda koruyun. Dilim kültürü, sonraki tahliller için hazırdır.

Kuyucuk başına 1 mililitre dilim kültürü bakım ortamı içeren altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna boş PTFE kültür eklerini yerleştirmek için steril forseps kullanarak başlayın. Tüm ekler eklendiğinde, plakayı 37 santigrat derece ve% 5 CO_2'de nemlendirilmiş su ceketli bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Daha sonra, tümör dokusu parçalarını buz gibi soğuk işleme ortamı içeren bir Petri kabına yerleştirin ve yapışan kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için dokuyu üç kez taze ortamla nazikçe yıkamak için bir pipet kullanın. Üçüncü yıkamadan sonra, tümör parçalarını yaklaşık 3 x 3 x 10 milimetrelik şeritler halinde kesmek için bir neşter kullanın, bağlı damarları dikkatlice çıkarın ve nekrotik veya koterize dokudan kaçının.

Dokunun tamamı kesildiğinde, 2 küp plastik gömme kalıbına 5 ila 7 mililitre 37 santigrat derece sıvı agaroz ekleyin ve agarozu bir dakika boyunca bir buz yatağında soğutun. Uzun eksen dikey olarak yönlendirilmiş olarak agarozun içine 2 ila 4 şerit doku yerleştirin ve dokuları yerleştirildikten sonra 2 ila 5 dakika daha buz üzerinde bırakın.

Agaroz katılaştığında, agarozu kalıptan nazikçe çıkarmak için kalıbın kenarlarını bir neşter ile kesin ve agaroz bloğunu bir vibratom numune plakasına sabitlemek için bol miktarda siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın.

Yapıştırıcı sertleştiğinde, agaroz bloğunu buz gibi soğuk işleme ortamına daldırın ve vibratom rezervuarı içindeki ortama %5 CO₂ %95 O₂ karışımını köpürtmek için kesilmiş, steril bir plastik pipet kullanın. Vibratom dilim kalınlığını 300 ila 350 mikron arasında ayarlayın ve bıçağın gelişmiş hızını ve bıçak genliğini doku kıvamına ve vibratom özelliklerine göre ayarlayın.

Planlanan deneysel analize göre uygun sayıda dilim elde edin. Dilimleri elde edildikleri gibi buz gibi soğuk işleme ortamı içeren bir Petri kabına aktarmak için paslanmaz çelik bir mikro spatula kullanarak. Tüm dilimler elde edildiğinde, her dilimi tek bir PTFE ekine aktarmak için mikro spatulayı kullanın.

12 ila 24 saatlik bir inkübasyondan sonra, hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika boyunca taze dilim kültür bakım ortamı içeren yeni bir altı oyuklu plakayı dengeleyin. Ardından, her bir parçayı kenardan kavramak için steril forseps kullanın ve ekleri yeni altı oyuklu plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın.