İnsan Kan-Beyin Bariyerinin Üçlü Hücre Kültürü Modelinin Geliştirilmesi

Kuyu ekinin alt tarafına perisitler ekleyerek başlayın.

İyi eki bir kültür plakası ile örtün ve inkübe edin.

Perisitler, kuyu ekinin zarına yapışarak tek hücreli bir tabaka veya tek tabaka oluşturur.

Başka bir kültür plakası alın.

İnsan astrositlerini uygun bir ortamda kuyuya ekleyin. Ardından plakayı inkübe edin.

Astrositler kuyunun dibine yapışır ve tek tabaka oluşturur.

Ortamı atın ve taze astrosit ve perisit ortamı ekleyin.

Şimdi, perisit tabakası ile iyi eki içeren kültür plakasını alın.

Plakayı ters çevirin ve kuyu ekini astrosit tabakasını içeren kuyuya aktarın.

İnsan beyni endotel hücrelerini kuyu ekinin üst tarafına ekleyin ve inkübe edin.

Endotel hücreleri, kan dolaşımını ve beyni ayıran çok önemli bir arayüz olan kan-beyin bariyerine benzeyen üçlü bir hücre kültürü sistemi oluşturarak kuyu ekine bağlanır.

HBVP'yi, birleşene kadar 37 santigrat derecede% 5'lik bir karbondioksit inkübatörü içinde hücre yapışması için aktif bir yüzeye sahip T75 kültür şişelerinde yetiştirerek başlayın. Birleşme noktasına ulaşıldığında, eski parazit ortamını aspire edin ve hücreleri 5 mililitre ılık Dulbecco'nun PBS'si ile yıkayın. Dulbecco'nun PBS'sini aspire edin ve 4 mililitre ılık tripsin-EDTA çözeltisi ve 1 mililitre Dulbecco'nun PBS'sinin bir kombinasyonunu kullanarak hücreleri şişeden ayırın.

Şişeyi bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede 5 dakika inkübe edin. Hücrelerin şişeden ayrılıp ayrılmadığını doğrulamak için mikroskop altında görüntüleyin. Şişeye% 2 FBS içeren 5 mililitre ılık parazit ortamı ekleyin ve ayrılan hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu 200 g'da üç dakika santrifüjleyin ve hücrelerin tüpün dibinde bir pelet oluşturmasına izin verin.

Ortamı tüpten aspire edin, hücre peletinin sağlam kaldığından emin olun. Hücre peletini parazit ortamında yeniden süspanse edin. Hücrelerin birleştiği yere ve ihtiyaç duyulan kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak ortam miktarını hesaplayın. Yeniden askıya alınmış hücrelerin 10 mikrolitresini alın. Bunları bir hücre sayma slaydına yerleştirin ve hücre sayısını sayın.

Hücre yoğunluğunu belirleyin ve 1 mililitre parazit ortamında ek parça başına 300.000 hücreyi kuyu eklerinin lümen tarafına tohumlayın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi% 2 FBS içeren astrosit ortamını kullanarak birincil insan astrositlerini yetiştirin. Hücre yoğunluğunu belirleyin ve doku kültürü 6 oyuklu plakaların dibine oyuk başına 300.000 hücre tohumlayın. Buharlaşmayı önlemek için plakayı örtün ve gece boyunca inkübe edin.

İnkübatörden perisitleri içeren kuyu eklerinde astrositler içeren doku kültürü 6 oyuklu plakaları çıkarın. Astrosit ortamını doku kültürü 6 oyuklu plakalardan aspire edin ve her oyuğa 1 mililitre parazit ortamı ve 1 mililitre astrosit ortamı ekleyin.

Perisit ortamını kuyucuk eklerinden aspire edin ve bunları tohumlanmış astrositleri içeren doku kültürü 6 oyuklu plakalara yerleştirin. Tohum HBMEC kuyu başına 300.000 hücre yoğunluğunda 2 mililitre tam klasik besiyerinde aynı kuyu eklerinin apikal tarafına.