JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:02 dk • July 8th, 2025
Gliomasferler, bir beyin tümörü veya glioblastomdan türetilen hücre agregatları ile başlayın.
Ayrışma enzimleri ekleyin. Glioblastoma hücrelerini ayırmak ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için inkübe edin.
Daha sonra, enzim aktivitesini durdurmak için serumla zenginleştirilmiş bir kültür ortamı ekleyin.
Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın, ardından hücreleri yeniden askıya alın.
Süspansiyonu süzün, ardından santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
Küçük peptitler içeren hidrojel öncülerindeki hücreleri yeniden süspanse edin.
Bu karışımı, hyaluronik asit içeren önceden monte edilmiş bir silikon kalıpla kuyucuklara yükleyin.
Çözeltiyi karıştırın. Hyaluronik asit ve hidrojel öncüleri arasındaki etkileşime izin vermek için inkübe edin ve hücre sıkışmasını kolaylaştıran bir hidrojel oluşturun.
Hücre sağkalımını sürdürmek için hidrojeli kültür ortamı ile kaplayın.
Kalıbı söktükten sonra hidrojeli inkübe edin.
Hidrojel içinde, hücreler üzerindeki yapışma proteinleri, öncü peptitler ve hyaluronik asit ile etkileşime girer.
Bu, hücrelerin küçük kümeler oluşturmasına ve üç boyutlu bir kültür geliştirmesine neden olur.
Başlamak için, doku kültürü ile muamele edilmemiş 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna temiz, kuru silikon kauçuk kalıplar yerleştirin ve kalıpları plakanın dibine yapıştırmak için bir pipet ucunun temiz künt ucunu kullanın. Kalıplar ve kuyu dipleri arasındaki sızdırmazlığı kontrol ettikten sonra, ayrışmış glioma kürelerini bir glioblastoma hücre kültüründen santrifüjleme ile toplayın ve peleti bir mililitre hücre ayrışma enzimi içinde yeniden süspanse edin.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra, tüpü hafifçe vurarak çalkalayın ve enzimatik reaksiyonu dört mililitre tam ortamla durdurun. Hücreleri tekrar santrifüjleyin ve hücreleri 70 mikrometrelik bir filtreden süzmeden önce peleti bir mililitre taze tam ortamda yeniden süspanse edin. Süzgeci ilave dört mililitre tam ortamla yıkayın ve süspansiyonu santrifüj tüpü başına 8 x 104 hücreli iki alikota bölün.
Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve 80 mikrolitre taze hazırlanmış polietilen glikol maleimid veya PEG-Mal-RGD içinde bir peleti ve kalıp başına 80 mikrolitre taze hazırlanmış PEG-Mal-CYS çözeltisinde bir peleti yeniden süspanse edin. 200 mikrolitrelik geniş ağızlı bir mikropipet ucu kullanarak, her bir kauçuk silikon kalıba 40 mikrolitre hyaluronik asit çözeltisi ekleyin, ardından 40 mikrolitre PEG-Mal-CYS veya PEG-Mal-RGD hücre çözeltisi ekleyin, karıştırmak için kalıp başına en fazla 10 kez hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin.
Hızlı jelleşme süresi nedeniyle, iki hidrojel bileşeni karıştırıldıktan sonra, çözeltileri hızlı ama kapsamlı bir şekilde karıştırmak için geniş delikli bir pipet ucu kullanmak önemlidir. Bu adım pratik gerektirir.
Daha sonra, jel kapsüllü hücreleri 5 ila 10 dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2 hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, her jele 2 ila 2,5 mililitre kültür ortamı ekleyin ve jelleri kalıpların kenarlarından nazikçe ayırmak için steril, iki mikrolitrelik bir pipet ucu ve forseps kullanın. Ardından, kalıpları plaka kuyucuklarından çıkarmak için sterilize edilmiş forseps kullanın ve plakayı hücre inkübatörüne geri koyun.