Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerinde Purkinje Hücre Sağkalımının Analizi

Bir fare yavrusu beyni ile başlayın.

Beyinciği izole edin ve uygun kalınlıkta doku dilimleri elde edin.

Dilimleri, ortam içeren kültür plakası kuyucuklarına yerleştirilen membran eklerine aktarın.

Tedavi edilmiş kuyucuklarda, ortam bir nöroprotektif test bileşiği içerir. Kontrol kuyuları bileşikten yoksundur. Kuluçkaya yatmak.

Kontrol koşulları altında, serebellar Purkinje hücreleri, in vivo olarak erken doğum sonrası gelişimi taklit eden apoptoza uğrar.

Tedavi edilen kuyularda, potansiyeline bağlı olarak, bileşik hücreleri apoptozdan koruyabilir.

Hücresel bütünlüğü korumak için dilimleri yıkayın ve sabitleyin.

Hücre zarlarını geçirgen hale getirmek ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için dilimleri geçirgenleştirme engelleyici bir çözeltiye aktarın.

Purkinje hücrelerinde spesifik olarak eksprese edilen kalsiyum bağlayıcı bir proteini hedefleyen birincil antikorlarla kaplama.

Primer antikorları hedef alan florofor konjuge sekonjene sekonder antikorları yıkayın ve ekleyin.

Çekirdekleri DNA bağlayıcı bir boya ile boyayın ve dilimleri birleştirin.

Konfokal bir mikroskop kullanarak, test bileşiğinin nöroprotektif potansiyelini belirlemek için canlı Purkinje hücrelerini ölçün

Beyincik'i hasat etmek için, yavru kafasını burnundan kavramak için düz pansuman forseps kullanın ve kafa derisini arka uçtan orta hatta yanal olarak kesmek için düz göz makası kullanın. Beyinciğe zarar vermemek için makas uçlarını dışa doğru işaret ederek kafatasını aynı şekilde kesin ve beyni soğuk HBSS ve mililitre başına 5 miligram glikoz içeren 60 milimetrelik bir tabağa aktarmak için bir spatula kullanın.

Beyincik'i dikkatlice incelemek için düz pansuman forsepslerini kullanın ve dokuyu bir doku doğrayıcının kesme masasındaki plastik bir diske yerleştirmek için steril kavisli ince forseps kullanın. Parasagital bölümlerin alınmasına izin vermek için dokuyu yönlendirmek için kesme tablasını döndürün ve bıçak dokunun kenarına yerleştirilene kadar kesme tablasını hareket ettirmek için tabla serbest bırakma düğmesini sağa doğru çekin. Ardından dilim kalınlığını 350 mikrometreye ve bıçak hızını orta dereceye ayarlayın ve doğrayıcıyı çalıştırın. Beyinciğin tamamı dilimlendiğinde, doğrayıcıyı kapatın.

Steril forseps kullanarak, diski 60 milimetrelik yeni bir tabağın üzerinde tutun. Dilimlerin tabağa düşmesi için HBSS artı glikozu disk üzerinden yıkamak için bir transfer pipeti kullanın. Ardından, numunelere mümkün olduğunca az dokunarak, dilimleri ayırmak için bir mikroprob kullanın.

Beyinciğin vermise yakın bölümlerini altı oyuklu plakadaki ayrı hücre kültürü eklerine seçmek için transfer pipetini kullanın ve dilimleri her bir ekin merkezine yerleştirmek için mikroprobu kullanın. Tüm dilimler yerleştirildiğinde, fazla HBSS artı glikozu dikkatlice aspire edin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

İmmünofloresan boyama için, süpernatanı her bir oyuktan çıkarın ve ekleri PBS ile yıkayın. Dilimleri 1 mililitre soğuk% 4 paraformaldehit ile her bir parçanın kuyucuğuna ve her bir parçanın üzerine 1 saat boyunca 500 mikrolitre sabitleyin.

Fiksasyonun sonunda, bir orbital çalkalayıcı üzerinde yıkama başına her bir parçanın altında 1 mililitre taze PBS ve her bir parçanın üzerine 500 mikrolitre taze PBS ile ekleri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın. 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre PBS-TB ile önceden doldurun ve her bir hücre kültürü ekinden serebellar dilimleri 24 oyuklu bir plakanın ayrı oyuklarına aktarmak için bir boya fırçası kullanın.

Dilimleri oda sıcaklığında bir saat boyunca geçirgen hale getirin ve bloke edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri, orbital çalkalayıcı üzerinde 4 santigrat derecede gece boyunca PBS-TB içinde seyreltilmiş 200 mikrolitre ilgilenilen birincil antikor ile etiketleyin.

Ertesi sabah, dilimleri 10 dakika boyunca dört kez yıkayın ve çalkalayıcı üzerinde yıkama başına 500 mikrolitre taze PBS yıkayın, ardından numuneleri uygun florofor konjuge ikincil antikorlarla etiketlemeden önce, ışıktan korunan oda sıcaklığında çalkalayıcıda iki saat boyunca yıkayın.

İnkübasyonun sonunda, bölümleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 10 dakika boyunca oyuk başına 500 mikrolitre uygun bir nükleer leke ile karşı boyayın ve dilimleri cam slaytlara monte etmek için bir transfer pipeti kullanın.

Ardından, PBS ile yeniden sulandırmadan ve dokuları yaklaşık 80 mikrolitre montaj ortamı ile kaplanmış lameller ile monte etmeden önce bölümlerin tamamen kurumasını bekleyin. Montaj ortamı sertleştikten sonra, serebellar bölümler görüntülenmeye hazırdır.