JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:00 dk • July 8th, 2025
İnsan embriyonik kök hücrelerini matris kaplı çok kuyulu bir plaka üzerine ekerek başlayın.
Matris ortamı, özel bir hücreye zamansız olgunlaşmayı önler.
Dimetil sülfoksit veya DMSO ile desteklenmiş uygun bir bakım ortamı ekleyin.
DMSO tedavisi, hücrelerin olgunlaşma sinyallerine tepkisini artırır.
Ardından, ortamı spesifik inhibitörler içeren bir nöral indüksiyon ortamı ile değiştirin.
İnhibitörler, nöral olmayan hücre gelişiminin sinyallerini bloke ederek kök hücreleri nöral progenitör hücrelere veya NPC'lere dönüştürmeye yönlendirir.
NPC'leri ayırmak için ortamı bir ayırma solüsyonu ile değiştirin. İstenilen sayıda hücreyi başka bir çok kuyulu plakaya yeniden plakalayın.
NPC'lerin oligodendrosit öncü hücrelerine veya OPC'lere dönüşümünü teşvik etmek için DMSO ile desteklenmiş hücreye özgü bir farklılaşma ortamı ekleyin.
OPC'lerin oligodendrositlere dönüşmesini kolaylaştırmak için ortamı hücreye özgü bir olgunlaşma ortamı ile değiştirin.
Nöral progenitör hücre üretimini gerçekleştirmek için, H1 insan ES hücrelerini kültürleyin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi bunları nöral progenitör hücrelere transdiferansiyel hale getirin. Negatif 1. günde, büyüme faktörü indirgenmiş matris çözeltisi ile kaplanmış 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna ES hücre bakım ortamındaki 0,5 ila 1 milyon hücreyi tohumlayın.
Sıfırıncı günde, hücreleri 24 saat boyunca% 2 DMSO ile desteklenmiş ES hücre bakım ortamı ile tedavi edin. 1'den 6'ya kadar olan günlerde, ticari bir kitten SMAD inhibitörleri içeren sıcak nöral indüksiyon ortamı ile tam ortamı değiştirin. 7. günde, hücre ayırma solüsyonu kullanarak NPC'leri geçin ve bunları 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 ila 2 x10 5 hücre oturma yoğunluğunda plakalayın.
Oligodendrosit öncü hücreleri oluşturmak için, NPC'leri ticari bir kitten SMAD inhibitörleri ile sıcak nöral indüksiyon ortamında plakalayın. 8. günde, OPC farklılaşma ortamında% 1 DMSO'luk bir çözelti hazırlayın ve kaplanmış NPC'leri 24 saat boyunca tedavi edin. 9. günde, ortamı DMSO içermeyen taze OPC farklılaşma ortamı ile değiştirin, ardından hücreleri 15. güne kadar her gün besleyin.
Hücreler 15. günden önce birleşirse, onları oyuk başına 1 ila 2 x 105 hücreli tohumlama yoğunluğuna geçirin. 14. günde, 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 1 ila 2 x 105 hücre yoğunluğunda OPC farklılaşma ortamındaki plaka OPC'leri. 15. günde, ortamı OL olgunlaşma ortamı ile değiştirin.
Ortamı her gün veya her gün değiştirin. Hücreler %90 birleşmeye ulaştığında, bunları en fazla iki geçiş için veya hücre bölünmesi önemli ölçüde yavaşlayana kadar 1'e 3 oranında bölün. OPC'ler çok hızlı bölünür ve üç günden daha kısa bir sürede birleşirse, bir ila üç gün boyunca 2 ila 5 mikromolar konsantrasyonda Ara-C ekleyin.