JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:08 dk • July 8th, 2025
Yapışık bir bazal membran matrisi üzerinde kültürlenmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre kolonileri ile başlayın.
Spesifik bir hormon, büyüme faktörü ve küçük molekül inhibitörleri içeren bir serebellar farklılaşma ortamı ekleyin.
Kolonileri bir cam pipet kullanarak kaldırın ve ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın.
Düşük bağlanma yüzeyi, hücreleri süspansiyon halinde tutar ve üç boyutlu embriyoid cisimlere veya EB'lere toplanmalarını kolaylaştırır.
Hormon, büyüme faktörü ve inhibitörler, ilgili hedef bölgelerine bağlanarak kök hücrenin nöronal progenitörlere farklılaşmasını teşvik eder.
EB'leri, EB bağlanmasını kolaylaştırmak için sentetik bir polimer ve bir yapışma proteini ile kaplanmış kültür plakası kuyucuklarına aktarın.
Ortamı inhibitör içermeyen bir farklılaşma ortamıyla değiştirin.
Hücreler EB'lerden dışarıya doğru göç etmeye başlar ve 2 boyutlu bir tek tabaka oluşturur.
Ortamı çıkarın ve bir serebellar olgunlaşma ortamı ekleyin.
Ortamdaki büyüme faktörleri, nöronal progenitörlerin farklı serebellar nöronal öncülere olgunlaşmasını indükler.
Sıfırıncı günde, 10 mikromolar Y27632 ile takviye edilmiş 1 mililitre serebellar farklılaşma ortamı ekleyin ve altı oyuklu ultra düşük ataşman veya ULA plakasının her bir oyuğuna SB431542 ekleyin ve kaldırılan koloniler kuyucuklara eklenmeye hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin. Farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipet kullanarak temizleyin. Ortamı aspire edin ve her 35 milimetrelik çanak için 1 mililitre iPSC pasaj çözeltisi ekleyin.
37 santigrat derecede üç dakikalık inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve 10 mikromolar Y27632 ve SB431542 ile desteklenmiş 2 mililitre serebellar farklılaşma ortamı ekleyin. İletilen ışığı ters çevirmiş bir mikroskobun 4X büyütmesi altında, çekilen cam pipetin bükülmüş kenarını kullanarak kolonileri kaldırın. Her koloni kaldırıldıktan sonra, tüm kolonileri 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak 6 oyuklu ULA plakasının bir kuyucuğuna nazikçe aktarın. Her iPSC plakası için bu işlemi tekrarlayın ve hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.
2. günde, mililitre başına 50 nanogramlık bir nihai konsantrasyonu ayarlamak için her bir oyuğa FGF2 ekleyin. 7. günde, 1 mililitre kullanılmış ortamı aspire ederek ve 1 mililitre taze serebellar farklılaşma ortamı ile değiştirerek ortamın üçte birini değiştirin. Embriyoid cisimciklerini yedi gün boyunca kuluçkaya yatırın.
14. günde, tüm embriyoid cisimciklerini plakanın merkezinde toplamak için plakayı döndürün. Ardından, plakayı eğin ve harcanan tüm ortamı kenardan 1000 mikrolitrelik bir pipetleyici kullanarak aspire edin. Orta miktar azaldıkça, plakayı yavaşça düz bir şekilde yatırın ve embriyoid cisimciklerinin kurumasını önlemek için yeterli ortam bırakarak aspire etmeye devam edin.
Daha sonra, 10 mikromolar ile desteklenmiş 3 mililitre taze serebellar farklılaşma ortamı ekleyin. Y27632 (İngilizce). Daha sonra, embriyoid cisimciklerini 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak poli-L-Ornitin laminin kaplı bir tabağa aktarın. 15. günde, besiyerini aspire edin ve taze serebellar farklılaşma besiyeri ile değiştirin.