JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 4:48 dk • July 8th, 2025
Miyelinli sinir açısından zengin bir ortamda glial progenitör hücrelerden türetilen bir tümör olan yaygın intrinsik pontin glioma içeren beyin sapı dokusu parçalarıyla başlayın.
Dokunun hücre dışı matrisini bozmak için proteolitik enzimlerle tedavi edin.
İnkübasyondan sonra, hücre ayrışmasını ve miyelin kılıfının bozulmasını kolaylaştırmak için içeriği tekrar tekrar pipetleyin.
Hücreleri toplamak için filtreleyin ve santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve soğuk bir tamponda tekrar süspanse edin.
Yoğunluk gradyanı ayrımı için bir sükroz çözeltisi ekleyin ve iyice karıştırın.
Ardından, daha ağır hücreleri daha hafif miyelin kalıntılarından ayırmak için santrifüjleyin.
Miyelin tabakasını çıkarın ve bir RBC lizis tamponu ekleyin.
Lizis etkisini durdurmak için soğuk bir tampon ekleyin. Parçalanmış RBC'leri ortadan kaldırmak için süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.
Hücreleri ılık bir nörobazal ortamda yeniden süspanse edin ve kaplanmamış bir şişede kültürleyin.
Nörotropik faktörlerin yokluğu nöronal ölüme neden olurken, glial progenitör hücreler besinleri ve büyüme faktörlerini kullanarak proliferasyona yol açar. Büyüme faktörü seviyelerini korumak için taze ortam ekleyin.
Zamanla, bu hücreler kendiliğinden hücre kümelerine toplanır ve serbest yüzen nörosferler oluşturur.
Bu prosedürde, kalan doku parçalarını içeren konik tüpü beş dakika boyunca santrifüjleyin. Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve önceden ısıtılmış enzimatik sindirim solüsyonunu, her 1 mililitre doku için 5 mililitre sindirim solüsyonu olacak şekilde ekleyin. Ardından, konik tüp kapağını laboratuvar filmi ile kapatın ve reaksiyonu 37 santigrat derecede bir döndürücü üzerinde 30 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, numuneleri hafifçe ezin. 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, numuneyi 6 ila 8 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve aşırı hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Ardından, pipetin ucuna 1000 mikrolitrelik bir pipet ucu ekleyin ve numuneyi 6 ila 8 kez daha ezin.
Kalan parçaların tüpün dibine çökmesine izin verin. Daha sonra, hücre hala 100 mikronluk bir filtreden asılı durumdayken, enzimatik ayrışma etiketli yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe süpernatanı çıkarın ve süzün ve buz üzerinde saklayın. Bunu takiben, enzimatik ayrışma tüpünü beş dakika santrifüjleyin ve sakaroz gradyan santrifüjlemeye devam edin. Numune hala çözelti içinde süspanse edilmişse, beş dakika santrifüjleyin.
Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve dokuyu kalsiyum ve magnezyum içermeyen 20 mililitre soğuk HBSS'de yeniden süspanse edin. Ardından, soğuk HBSS ile hacmi 25 mililitreye getirin. Yavaş yavaş, 25 mililitre 1.8 molar sükroz çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için tüpü ters çevirin. Bu, 0.9 molar sükroz gradyanı ile sonuçlanır.
Daha sonra, numuneyi 10 dakika ara vermeden santrifüjleyin. Miyelin kalıntılarını ve mümkün olduğunca fazla sükroz çözeltisini dikkatlice aspire edin. Ardından, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 30 mililitre soğuk HBSS ekleyerek ve hafifçe karıştırarak numuneyi yıkayın. Bundan sonra, beş dakika boyunca santrifüj edin.
Bu prosedürde, yıkama süpernatantını çıkarın. 5 mililitre ACK lizis tamponu ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında bir dakika döndürerek hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Daha sonra, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 30 mililitre soğuk HBSS ekleyerek lizisi söndürün.
Daha sonra, beş dakika boyunca santrifüj edin. Son hücre peletini büyüme faktörleri ile 10 ila 15 mililitre ılık tam TSM'de yeniden süspanse edin ve tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hemositometrede canlı hücre yoğunluğunu ölçün. Daha sonra, son hücre süspansiyonunu yeni bir T75 kültür şişesine aktarın. Genel büyüme faktörü seviyelerini korumak ve tümör hücresi nörosferlerinin gelişimini izlemek için her gün ek büyüme faktörleri ekleyin.