Murin serebellar granüler nöron progenitörlerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi

Fare yavrusu cerebella'yı ele alalım.

Onları daha küçük parçalar halinde homojenize edin.

Dokunun hücre dışı matrisini sindirmek, serebellar granüler progenitörleri veya CGNP'leri ve astrositleri gevşetmek için bir proteolitik enzim ekleyin.

Enzimatik aktiviteyi durdurmak için serum içeren CGNP kültür ortamı ekleyin. Enzim açısından zengin süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Doku parçalarını CGNP ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri serbest bırakmak için dokuyu mekanik olarak ayırın.

Kalıntı çöktüğünde, hücreleri içeren süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.

Süpernatanı santrifüjleyin ve döküntülerle çıkarın.

Hücreleri CGNP ortamında yeniden süspanse edin ve bunları poli-D-lizin ile kaplanmış çok kuyulu plaka kuyucuklarına tohumlayın. Kuluçkaya yatmak.

Astrositler, CGNP'lere kıyasla poli-D-lizin kaplamaya güçlü bir şekilde yerleşir ve yapışır.

Plakayı sallayın ve CGNP içeren süpernatanı toplayın. Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.

CGNP'leri CGNP ortamında yeniden süspanse edin ve bunları poli-L-ornitin kaplı çok kuyulu bir plakaya yerleştirin. Kuluçkaya yatmak.

CGNP'ler kaplanmış yüzeye yapışır ve medya bileşenleri ve poli-L-ornitin tarafından desteklenerek çoğalır.

Üç ila beş serebellayı 15 mililitrelik tüplere aktarın. Santrifüjlemeden önce serebellayı HBSS glikozu ile yıkayın. Dokuyu toplamak için tüpleri santrifüjleyin. Son yıkamadan sonra, parçalar 0,5 ila 1 milimetre küp boyutunda olana kadar 1 mililitrelik bir pipetle iki ila üç kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek serebellayı homojenize edin.

2,5 mililitre kalana kadar tüm sıvıyı yavaşça çıkarın. Daha sonra, serebella içeren HBSS glikozlu tüpe% 0.05 tripsin ekleyin ve dokuyu 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Dokuyu her 1 ila 3 dakikada bir ters çevirin. İnkübasyonu takiben, 5 mililitre cGMP hücre kültürü ortamı veya CGM ekleyerek sindirimi durdurun ve dokuyu daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile toplayın.

Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve 1 mililitre CGM ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek dokuyu 1 mililitrelik pipet ucuyla ezin. Daha sonra 5 mililitre CGM ekleyin ve doku kalıntılarını yerleştirmek için karışımı buz üzerinde iki dakika inkübe edin. Doku yerleştikten sonra, süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Ardından, kalan dokuya 2 mililitre CGM ekleyin ve süpernatanı hasat etmeden ve doku kalıntılarını atmadan önce öğütme prosedürünü tekrarlayın.

Her 15 mililitrelik doku tüpünden süpernatanları toplayın ve serebellar hücreleri toplamak için santrifüjleyin. Peleti 10 mililitre CGM'de yeniden süspanse edin. Astrositler, poli-D-lizine cGMP'lerden daha hızlı ve daha güçlü yapıştığından, poli-D-lizin kaplı 6 oyuklu plakaların kuyucuklarına 4 mililitreye kadar hücre süspansiyonu ekleyin ve astrositleri çıkarmak için 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Plakayı sallayın. Süpernatanı 15 mililitrelik bir tüpte toplayın ve ardından süpernatanı daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Peleti 10 mililitre CGM'de tekrar süspanse edin ve hücreleri bir Neubauer sayma odası ile sayın. 4 ila 6 saat sonra, yapışan cGMP'ler yuvarlak görünür ve proliferatif olur. CGM'deki hücreleri poli-L-ornitin kaplı plakalar üzerine tohumlayın ve 37 santigrat derece,% 5 CO₂ ve% 100 bağıl nemde inkübe edin.