JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:00 dk • July 8th, 2025
Bir kültür ortamında uygun bir substrata bağlı insan pluripotent kök hücre kolonileri veya hPSC'ler ile başlayın.
Ortamı çıkarın. Spesifik inhibitörler içeren bir nöronal ortam ekleyin ve inkübe edin.
Bu inhibitörler, hPSC'lerin olgunlaşmasını nöroektodermal koloniler oluşturan bir nöronal soya doğru yönlendirir. Bunlar, sferoid adı verilen küçük, küresel yapıların öncüleridir.
Ortamı çıkarın ve bir tuz tamponu ile yıkayın.
Kolonileri plakadan ayırmak için bir sindirim enzimi ile inkübe edin.
Enzimatik aktiviteyi durdurmak için nöronal ortamı ekleyin.
Kolonileri toplayın ve bir tüpe aktarın.
Yerleşmelerine izin verin ve ardından süpernatanı atın.
Kolonileri bir büyüme faktörü içeren nöronal bir ortamda yeniden askıya alın.
Kolonileri çok kuyulu bir plakaya aktarın ve inkübe edin.
Bu büyüme faktörü, nöroektodermal hücrelerin kendi kendine organizasyonunu ve çoğalmasını kolaylaştırarak onları bir sferoid oluşturmaya yönlendirir.
Başlamak için, hPSC kolonilerini, %20 ila %30 yoğunluk elde etmek için %60 birleşimde 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğundan üç oyuğa hESC nitelikli bir bazal membran matrisi üzerinde plakalayın ve ardından 2D nöroektodermal kolonilerin indüksiyonu ile devam edin.
Önümüzdeki 3 gün boyunca her bir kuyucuğa günlük olarak çift SMAD inhibitörleri ile desteklenmiş taze N2 ortamı ekleyin. İndüklenmiş 2D nöroektodermal kolonilerden 3D nöroektodermal sferoidler oluşturmak için, 6 oyuklu plakadan 2 mililitre N2 ortamını çıkarın ve N2 ortamının tamamının çıkarıldığından emin olmak için HBSS ile bir kez yıkayın.
Koloni içeren her kuyucuğa 1 mililitre dispas ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 20 ila 25 dakika inkübe edin ve koloni ayrılmasını düzenli olarak kontrol edin. İnkübasyonun sonunda, dispas enziminin aktivitesini durdurmak için, kuyucuğa 1 mililitre N2 ortamı ekleyin. Geniş delikli bir P1000 pipet ucu veya steril makasla modifiye edilmiş bir P1000 pipet ucu kabı kullanarak, kolonileri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve koloni kümelerinin yerçekimi ile tüpün dibine batmasına izin verin.
Ardından, standart bir P1000 pipet ucuyla süpernatanı dikkatlice çıkarın. 1 mililitre taze N2 ortamı ile değiştirin ve dispasın tamamen çıkarılmasını sağlamak için yıkamayı üç kez tekrarlayın. Hücre kümelerini ve N2 ortamını yeniden süspanse ettikten sonra, hücre süspansiyonunu 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna aktarın ve mililitre bFGF başına 40 nanogram ekleyin.