$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Kök hücreler, nöronlar ve glia içeren yeni doğmuş bir fare beyinciğinden izole edilen hücreleri alın.
Kök hücreye özgü bir yüzey glikoproteinine bağlanan antikor kaplı manyetik mikro boncuklar ekleyin.
Santrifüjleyin, bağlanmamış boncukları çıkarın ve hücreleri bir tamponda yeniden askıya alın.
Hücreleri, diğer hücreler akarken mikroboncuk bağlı kök hücreleri tutan manyetik bir ayırıcıya yerleştirilmiş bir ayırma sütununa yükleyin.
Hücreleri elüte etmek için bir nörosfer ortamı ekleyin ve bunları bir mikroplakaya aktarın. Birincil nörosferlerin, kendi kendini yenileyen kök hücre kolonilerinin oluşumunu indüklemek için kuluçkaya yatırın.
Ortamı santrifüjleyin ve atın. Hücresel adezyon proteinlerini sindirmek için nörosferleri enzimler içeren bir ortamda yeniden askıya alın.
Enzimleri santrifüjleyin ve çıkarın. Nörosfer ortamını ekleyin ve hücreleri mekanik olarak ayırın.
Kök hücre çoğalmasına ve ikincil nöroküre oluşumuna izin vermek için kuluçkaya yatırılırken, kök hücre özelliklerine sahip olmayan farklılaşmış hücreler çoğalmaz.
Nörosferleri bir farklılaşma ortamına aktarın ve inkübe edin, nöronlara ve glialara farklılaşmayı teşvik edin.
Santrifüj tüplerini buzun üzerine yerleştirin, ardından ayrışmış hücreleri 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Hücrelerin ağdan geçmesini sağlamak için filtreyi 10 mililitre buz gibi soğuk HBSS solüsyonu ile doldurun.
Filtrelenmiş hücreleri 15 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve süspansiyonu 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı tamamen çıkarmak için bir vakum aspiratörü kullanın.
Hücre peletini 160 mikrolitre buz gibi soğuk manyetik kolon tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna 40 mikrolitre anti-prominin-1 mikroboncuk ekleyin. Daha sonra, antikorun prominin-1 eksprese eden hücrelere bağlanmasına izin vermek için tüpleri 15 dakika buzdolabında inkübe edin.
Hücreleri 1 ila 2 mililitre sütun tamponu X ile yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti 1 mililitre sütun tamponu X'te yeniden süspanse edin. Manyetik sütunları manyetik standa yerleştirin ve 500 mikrolitre tampon X ile bir kez durulayın. Etiketli hücre süspansiyonunu kolona uygulayın ve akışı taze 15 mililitrelik tüplerde toplayın.
Kolonu 500 mikrolitre tampon X ile üç kez yıkayın. Ardından, sütunları manyetik alandan çıkarın ve 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. 1 mililitre kültür ortamı ekleyin ve prominin-1 boncukları ile etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütuna itin.
Nörosferleri geçmek için, bunları kültür ortamı ile birlikte steril 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Nörosferleri 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleme ile peletleyin ve süpernatanı atın.
Peletleri 5 mililitre ayrışma ortamında papain veya% 0.05 tripsin çözeltisi ile yeniden süspanse edin ve hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Hücre süspansiyonunu tekrar santrifüjleyin. Daha sonra, hücreleri 5 mililitre nörosfer ortamında yeniden süspanse edin ve bir mera pipeti ile 10 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın. Hücreleri metin protokolünde tarif edildiği gibi nörosfer ortamında plakalayın ve daha önce tarif edildiği gibi kültürde 7 ila 10 gün sonra ikincil nörokürelerle zenginleştirin.