Sıçan Başı Kas Dokusundan Uydu Hücrelerini İzole Etmek İçin Bir Teknik

Bir sıçan kafası kası ile başlayın ve onu parçalara ayırın.

Bir proteolitik enzim kokteyli ekleyin ve hafifçe çalkalayarak inkübe edin.

Enzimler, dokunun hücre dışı matrisini sindirerek kas liflerini gevşetir.

Enzimleri inaktive etmek için serum proteinleri içeren ortam ekleyin.

Dokuyu bir tüpe aktarın, santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Ortamdaki dokuyu yeniden süspanse edin. Kas onarımı ve rejenerasyonu için çok önemli olan kök hücreler olan uydu hücrelerinin homojen bir süspansiyonunu elde etmek için mekanik bozulma ve santrifüjlemeyi iki kez tekrarlayın.

Uydu hücresi içeren süpernatanı toplayın.

Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için bir hücre süzgecinden geçirin. Santrifüjleyin, süpernatanı atın ve ortamdaki hücreleri yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunun damlalarını hücre dışı matriks protein kaplı oda kızağı kuyucuklarına yerleştirin.

Kaplanmış yüzey, uydu hücresinin bağlanmasını kolaylaştırır. Kuyulara medya ekleyin.

Ortamdaki büyüme faktörleri, uydu hücresi proliferasyonunu ve miyoblastlara farklılaşmayı indükler - kas hücresi öncüleri, bu da çok çekirdekli miyotüpler oluşturmak için daha fazla çoğalır ve birleşir.

Miyotüpler sonunda kas liflerine dönüşür.

Uydu hücrelerini izole etmek için, her bir kası altı oyuklu bir plakanın ayrı ayrı oyuklarına aktarın ve kasları çok fazla kıymamaya dikkat ederek dokuları 2 milimetrelik küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra, doku parçalarını her 20 dakikada bir hafifçe çalkalayarak 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede oyuk başına 2.5 mililitre% 0.1 pronaz çözeltisi içinde dikkatlice inkübe edin.

Lif demetleri gevşemiş bir görünüm gösterdiğinde, her bir oyuğa at serumu ve antibiyotiklerle desteklenmiş 2,5 mililitre DMEM ekleyin ve sindirilmiş dokuları ayrı ayrı 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Doku bulamaçlarını aşağı doğru döndürün ve süpernatanları boşaltın. Daha sonra, her tüpe 5 mililitre ortam ekleyin ve dokuyu 10 mililitrelik plastik bir pipetle homojenize edin.

Dokuları tekrar döndürün ve süpernatanları yeni 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Daha sonra, tüplere 5 mililitre daha orta ekleyin ve parçalar pipetten kolayca geçene kadar doku parçalarını tekrar ezin.

Başka bir santrifüjlemeden sonra, süpernatanları uygun karşılık gelen tüplere toplayın ve hücre süspansiyonlarını 40 mikrometre süzgeçlerden ayrı ayrı 50 mililitrelik tüplere süzün. Maksimum hücre geri kazanımı için süzgeçleri 1 mililitre DMEM ile yıkayın. Ardından, hücreleri aşağı doğru döndürün. Peletleri taze ortamda tekrar süspanse edin ve hücreleri sayın.

İzole edilmiş uydu hücrelerini kültürlemek için, daha sonra hücre süspansiyonlarını 10 mikrolitre kültür ortamı başına 1.5 x^{10 3} hücreye seyreltin. Daha sonra, önceden hazırlanmış her bir hücre dışı matris jel noktasına 10 mikrolitre hücre ekleyin ve jelleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Altı saat sonra, her bir jel noktasına dikkatlice 400 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve slaytları inkübatöre geri koyun. Üç gün sonra, uygun kültür ortamının eklenmesiyle hücrelerin farklılaşmasını başlatın.