Fare Embriyonik Karsinom Hücreleri kullanılarak Retinoik Asit Kaynaklı Nörogenez

Çeşitli hücre tiplerine farklılaşabilen bir fare embriyonik karsinom hücresi süspansiyonunu ele alalım.

Besiyeri ve retinoik asit içeren hidrofobik bir kültür kabı üzerindeki tohum hücreleri.

Kuluçkaya yatmak. Hidrofobik yüzeyler hücre yapışmasını önleyerek hücrelerin agregalar oluşturmasına neden olur.

Retinoik asit, hücre agregatlarına girerek sinyal yollarını tetikler ve nöronal progenitör hücrelere farklılaşmaya neden olur.

Kuluçka sonrası hücre agregalarını toplayın.

Medyayı atın.

Retinoik asit içeren besiyerini ekleyin ve agregaları hidrofobik bir kültür kabına tohumlayın.

Kuluçkaya yatmak. Retinoik asit, nöronlara sürekli hücresel farklılaşmayı kolaylaştırır.

Agregaları toplayın ve ortamı çıkarın.

Agregalar içindeki hücre-hücre adezyonlarını bozmak için bir proteolitik enzim ekleyin.

Enzimatik aktiviteyi durdurmak için serum içeren ortam ekleyin.

Agregaları mekanik olarak ayırın ve bir nöronal süspansiyon oluşturun.

Enzim açısından zengin süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Ortamdaki nöronları yeniden süspanse edin ve bunları ortam içeren çok kuyulu bir plaka üzerine tohumlayın.

Kuluçkaya yatmak. Nöronlar plakaya yapışır ve olgunlaşır, uzun çıkıntıları uzatır.

Agrega üretimi için, 100 mililitrelik işlenmemiş bir kültür kabına 5 mikrolitre RA ile desteklenmiş 10 mililitre farklılaşma ortamı ekleyerek başlayın. Kültür kabında 1 milyon hücre tohumlayın ve agrega oluşumunu teşvik etmek için iki gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, 10 mililitrelik bir pipet ile, agregaları içeren ortamı aspire edin ve oda sıcaklığında 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Agregaların dibe çökmesi için 1,5 dakika bekleyin ve ardından süpernatanı atın.

0.5 mikromolar RA ile desteklenmiş 10 mililitre taze farklılaşma ortamı ekleyin. Agregaları 100 milimetrelik yeni bir işlem görmemiş kültür kabına nazikçe tohumlayın ve iki gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Başlamak için, hücre agregalarını 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Agregaların dibe çökmesi için oda sıcaklığında 1,5 dakika bekleyin ve ardından süpernatanı atın. Agregaları serum ve antibiyotiksiz DMEM ile yıkayın. Hücre agregalarının dibe çökmesini bekleyin. Süpernatanı atın ve 2 mililitre% 0.25 tripsin EDTA ekleyin.

Tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosunda 10 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri süspansiyonda tutmak için her iki dakikada bir hafifçe vurun. Ardından, tripsin aktivitesini durdurmak için 4 mililitre bakım ortamı ekleyin ve 1 mililitrelik bir pipet kullanarak 20 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Son olarak, hücreleri 200 kez g ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 5 mililitre bakım ortamında yeniden askıya alın. Hücre numarasını belirlemek için bir hücre sayacı kullanın ve hücreleri kaplamaya devam edin. Plaka hücrelerine önce, altı oyuklu bir kültür plakasına bakım ortamı kuyusu başına 3 mililitre ekleyin. Ardından, hücreleri oyuk başına 500.000 yoğunlukta tohumlayın. Plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.