JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 4:27 dk. • July 8th, 2025
Bir büyüme ortamında birincil oligodendrosit öncü hücrelerinin veya OPC'lerin yapışık kültürlerini alın.
Kontrol kuyusuna kontrol lentiviral vektörleri ekleyin ve miyelinleşmeyi düzenleyen sinyal proteinlerini kodlayan test vektörlerini test kuyusuna ekleyin, ardından inkübe edin.
Hücreler vektörleri içselleştirir ve viral RNA, DNA'ya ters kopyalanır ve konakçı genomuna dahil edilir, bu da test hücrelerindeki sinyal proteinlerini ifade eder.
OPC'leri substrattan ayırmak için enzimleri tanıtın.
Enzimleri nötralize edin ve enzimleri çıkarmak için santrifüjleyin.
Büyüme ortamını ekleyin ve OPC'leri, yapışmış dorsal kök ganglionu veya DRG nöronları olan bir mikroplaka içindeki lamellere aktarın. OPC'lerin yerleşmesine izin verin.
Kuyuları büyüme ortamı ile doldurun ve inkübe edin. DRG nöronları ile etkileşim, OPC'nin oligodendrositlere olgunlaşmasını tetikler.
İfade edilen sinyal proteinleri, oligodendrositleri DRG nöronları etrafında miyelin kılıfları oluşturmaya indükler.
Kontrol vektörü ile transdüksiyonlu hücrelere kıyasla test hücrelerinde sinyal proteininin neden olduğu miyelin kılıf oluşumunu değerlendirin.
Bu protokol için, aşağıdaki büyüme faktörlerini içeren 10 mililitre SATO ortamı ile 10 santimetrelik plakalarda kültürlenmiş primer oligodendrosit öncü hücrelerine, OPC'lere sahiptir - CNTF, PDGF, NT3 ve Forskolin. Hücreler 24 saat boyunca% 8 karbondioksit altında kültürlenmiş olmalıdır.
Ortamı aspire etmekle başlayın ve tamamen çıkarın. Ardından, büyüme faktörleriyle aynı ortamdan 10 mililitre ile değiştirin. OPC'lerinizi lentivirüs ile enfekte edin, gerekli miktarda virüsü ortama damla damla ekleyerek ilgilenilen proteini ifade edin.
Ayrıca, ayrı bir OPC plakasında, sadece GFP'yi ifade eden kontrol lentivirüsünü ortama karıştırın. Hücreleri 48 saat daha kültürleyin, daha sonra kültürlenmiş DRG nöronlarına tohumlamak için OPC'leri plakalardan toplayın.
İlk olarak, her plakayı 8 mililitre EBSS ile iki kez durulayın. 9 mililitre ılık EBSS ile 1 mililitre tripsin-EDTA% 0.05 oluşturun. Her plakaya 5 mililitre seyreltilmiş tripsin ekleyin. 37 santigrat derecede iki dakikaya kadar inkübe edin. EBSS'ye 5 mililitre% 30 FBS ekleyerek tripsini nötralize edin.
Ardından, 10 mililitrelik bir pipet kullanarak OPC'leri plakanın yüzeyinden yıkayın. Tüm hücreleri toplamak için plakayı her seferinde çeyrek tur çevirin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 180 g'da 15 dakika santrifüjleyin.
Şimdi, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini büyüme faktörleri olmadan bir mililitre ılık SATO ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Daha sonra, 22 milimetrelik lameller üzerinde kültürlenen DRG nöronlarını, ortamı plakalarından tamamen aspire ederek hazırlayın.
Ardından, her bir lamel için 200.000 OPC'yi damla damla nazikçe tohumlayın. Tohumlama hacmi, lamel başına 200 mikrolitreden az olmalıdır. Plakayı hareket ettirmeden hücrelerin yerleşmesine izin verin. 10 dakika sonra, her bir kuyucuğu bir mililitre ılık SATO ortamı ile doldurun. Şimdi kalan kardeş OPC'leri büyüme faktörleri içeren SATO ortamı ile yeniden plakalayın. Daha sonra ilgilenilen proteinin ekspresyonunu doğrulamak için kullanılabilirler.