Murin Beyninden Floresan Etiketli Nöronların İzole Edilmesi

JoVE Encyclopedia of Experiments

Sinirbilim

0 görüntüleme • 4:35 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan protein eksprese eden nöronlar içeren transgenik bir fare korteksi alın.

Bir numune tutucuya sabitleyin.

Dokunun fizyolojik koşullarını korumak için tutucuyu oksijenli aCSF içeren vibratom tepsisine monte edin.

Ayarlanan parametreleri kullanarak koronal dilimler elde edin.

Dilimleri, stabilize etmek için oksijenli aCSF ve aktivite blokerleri içeren gözenekli bir tutucuya yerleştirin.

Hücre dışı matrisi sindirmek ve hücreleri gevşetmek için dilimleri proteazlarla muamele edin.

Proteazları çıkarmak için aCSF ile yıkayın.

Dilimleri aCSF ve serum içeren bir kültür plakasına aktarın.

Bir floresan mikroskobu altında, floresan nöronlar içeren dilim bölgelerini inceleyin.

Diseke edilen parçaları aCSF ve serum içeren bir tüpe aktarın.

Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için dokuyu mekanik olarak ayırın. Hücreleri aCSF içeren bir kültür plakasına aktarın.

Floresan mikroskobu altında, floresan nöronları toplamak için bir kılcal pipet kullanın.

Daha fazla analiz için bu nöronları aCSF içeren bir kültür plakasına dağıtın.

Kafatasını küçük bir makasla açarak ve kortekse zarar vermeden ince forseps kullanarak taze beyni çıkararak ötenazi yapılmış bir fareden beyni inceleyin. Beyni soğutulmuş ve oksijenli aCSF'ye yerleştirin ve kesitin tüm süresi boyunca %5 karbondioksit dengeli oksijene bağlı bir hava taşı bırakın.

Beyni vibratom aynasına yerleştirin ve koronal veya sagital bölümleri 300 mikron kalınlığında kesin. En az 10 ila 50 etiketli hücre elde etmek için gerektiği kadar çok bölüm toplayın. Dilimleri, oksijenli aCSF ile yıkanmaları için bir beherin içine yerleştirilmiş pamuk gözenekli bir dilim tutucuya koyun.

Dilimleri, aktivite blokerleri ile aCSF içeren behere taşıyın ve bir hava taşı kullanarak oksijeni köpürtürken oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika bloke edin. Oda sıcaklığında hafif sindirim gerçekleştirmek için dilimleri proteaz çözeltisi ile aCSF içeren behere taşıyın. Sindirimi takiben, oda sıcaklığında 5 ila 10 dakika boyunca aktivite engelleyici solüsyon ile dilimleri aCSF içeren behere geri hareket ettirerek proteazı yıkayın. Oksijen köpürmeye devam edin.

Daha sonra, oda sıcaklığında% 1 FBS içeren aCSF içeren 100 milimetrelik bir Petri kabı hazırlayın ve mikrodiseksiyon için ayrı bölümleri tabağa taşıyın. Floresan diseksiyon kapsamı altında, en az 10 ila 50 hücreye sahip alanları ve ilgi katmanlarını mikro diseksiyon yapmak için bir çift ince forseps kullanın.

Bir Pasteur pipeti kullanarak, mikro disseke edilmiş parçaları, aCSF çözeltisinde yaklaşık 0,8 mililitre% 1 FBS içeren 2 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne taşıyın. Diseke edilen dokuyu mikrofüj tüpünde oda sıcaklığında tritura edin.

Alevli Pasteur pipetlerinin her biriyle, en büyüğünden başlayıp en küçük çıkış çapıyla bitecek şekilde yaklaşık 10 vuruş gerçekleştirin. Ayrışmış hücreleri oksijenli aCSF içeren 100 mililitrelik bir Petri kabına dağıtın ve hücrelerin yavaş yavaş yerleşmesi için 5 ila 7 dakika bekleyin.

Diseksiyon mikroskobu altında GFP ve RFP sinyalini gözlemleyin. Parlak alan aydınlatması altında morfolojiyi inceleyerek kalıntıları tanımlayın. Çok az döküntü içeren bir hücre alanı tanımlandıktan sonra, boru valfinin ucunu dil ile bloke ederek hücreleri almak için kılcal ve bağlı boruyu kullanın. Ardından, kılcal damarı hücrelere yakın konumlandırın. Kılcal damar üzerindeki bloğu serbest bırakın ve kılcal hareket kullanarak hücreyi yakalamak için hızlı bir şekilde tekrar bloke edin.

Kılcal damarı taze oksijenli aCSF içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına taşıyın ve hücreleri tabağa dağıtmak için floresan optikler altında kılcal ucu gözlemlerken tüpe hafifçe üfleyin. 100 ila 150 hücre toplanana kadar toplama prosedürünü tekrarlayın ve parlak alan diferansiyel girişim kontrast optiklerinde döküntü gibi kirleticilerin minimum düzeyde olduğundan emin olun.

08:01

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:05

Çok sayıda miyeloid ataları ve dendritik hücre öncüleri fare kemik iliği strateji sıralama bir roman hücre kullanarak gelen nesil

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:57

Floresans ile kurulan Purified Gabaerojik veya glutamaterjik nöronların primer hücre kültürü-aktif hücre sıralama

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:21

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:35

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

İlgili videolar

0 Görüntüler

12:32

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir In vivo

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:43

Konfokal mikroskopi kullanılarak fare nöral kök hücre bölünmesinin hızlandırılmış görüntülenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:40

Lazer güdümlü Nöronal İzleme Beyin Eksplantlarındaki

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:50

Birincil fare nöronlar ayrı için ön montajı plastik mikrosıvısal çip kullanımı

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:49

Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 15 Ağustos 2026