JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:34 dk. • July 8th, 2025
Bir filtre kağıdı çerçevesi içinde desteklenen bir civciv embriyosu alın ve diseksiyon mikroskobu altında konumlandırın.
Embriyoyu çevreleyen koruyucu bir kaplama olan vitellin zarını çıkarın.
Optik lobların arkasında ve olgun kalbin embriyonik öncüsü olan kalp hilalinin önünde bulunan orta beyin nöral kıvrımlarını tanımlayın.
Nöral kıvrımlar, gelişim sırasında göçmen hücrelere dönüşen multipotent kök hücreler olan premigrasyon nöral krest hücrelerini içerir.
Bu göçmen hücreler, nöronal ve nöronal olmayan hücrelere farklılaşır.
Nöral kıvrımların en dorsal yönünü eksize edin ve dokuyu tampon içeren bir kültür kabına aktarın.
Daha sonra, bir yapışma proteini ile kaplanmış lamelleri, ortam içeren kültür plakası kuyucuklarına yerleştirin.
Nöral kıvrımları kaplanmış lamellerin üzerine aktarın. Doku bağlanmasını kolaylaştırmak için inkübe edin.
Kültürleme sırasında, göçmen nöral krest hücreleri, nöral kıvrımlardan kaplanmış yüzeye çıkar ve bir nöral krest hücre kültürü oluşturur.
Bir embriyoyu Ringer'ın Pen-Strep solüsyonunu içeren temiz bir kaba aktarın. Görüşü engelleyen yumurta sarısını temizlemek için embriyoyu nazikçe ileri geri çevirin ve Ringer'ın Pen-Strep solüsyonunu değiştirin veya hava bulanıklaşırsa taze bir tabağa aktarın. Embriyo sırtını ve çerçeve tarafı yukarı bakacak şekilde diseksiyon mikroskobu altında konumlandırın. Embriyoyu gergin tutmak ve yerinde tutmak için kağıt çerçeve üzerinde bırakın.
Ardından, nöral kıvrımları ortaya çıkarmak için forseps kullanarak vitellin zarını çıkarın. Genişleyen optik veziküllere doku kaudal ve eşkenar dörtgen daralmalarının yeni ortaya çıkmaya başladığı arka beyne rostral ekleyin. Yaylı makas kullanarak, orta beyin nöral kıvrımlarını dikkatlice çıkarın. Nöral tüp ve nöral olmayan ektodermin minimum kontaminasyonu ile nöral kıvrımın dorsalmost yönünü eksize etmeye özen gösterin ve nöral kıvrımları bir P20 pipetleyici veya sarısı Ringer's Pen-Strep solüsyonu ile durulanmış steril bir cam Pasteur pipeti kullanarak Ringer's Pen-Strep solüsyonu içeren temiz bir tabağa aktarın.
Ek kıvrımları incelerken toplanan kıvrımları buz üzerinde saklayın. Kültür kabını inkübatörden çıkardıktan sonra, fibronektin çözeltisini lamel kabından veya kuyudan çıkarmak için bir pipetör veya Pasteur pipeti kullanın. Fibronektin kaplı substratı Ringer's Pen-Strep solüsyonu ile duruladıktan sonra, tabağa veya kuyucuğa uygun hacimde tam kültür ortamı ekleyin.
Plastiği bloke etmek ve dokunun yapışmasını önlemek için bir P20 veya P200 pipetleyici kullanın ve pipet ucunu sarısı Ringer's Pen-Strep solüsyonu ile durulayın. Daha sonra, izole edilmiş nöral kıvrımları fibronektin kaplı lamel merkezine doğru aktarın ve mümkün olduğunca az Ringer's Pen-Strep solüsyonu aktarmaya özen gösterin. Eksplantların 10 ila 15 dakika dinlenmesine izin verdikten sonra, kaplanmış nöral kıvrımlara sahip kültür kabını yavaş ve dikkatli bir şekilde taşıyarak 38 santigrat derecede nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin.