Vestibüler Ganglion Nöronlarının Bir Fare İç Kulağından İzole Edilmesi

Bir fare yavrusunun kafasının yarısını alın ve beynini çıkarın.

Kafatasının üst kısmını kesin ve iç kulak yapılarını koruyan kemikli bir dış tabaka olan otik kapsülü görselleştirmek için çevredeki dokuyu çıkarın.

Dokuyu tamponlu bir ortam içeren bir kültür plakasına aktarın.

Vestibüler sinir hücresi gövdelerini içeren superior ve inferior vestibüler gangliyonları ayırın.

Kemikli sırtı tıraş edin ve alttaki üstün ganglionu hasat edin.

Superior ganglionu, tamponlu ortamı içeren yeni bir plakaya aktarın.

İzole edilmiş ganglionu temizlemek için yapışan dokuları yüzeyden çıkarın.

Gangliyonu proteolitik enzimler içeren bir çözeltiye yerleştirin.

Enzimler, dokunun hücre dışı matrisini bozarak hücreleri gevşetir.

Gangliyonu, kültür ortamı içeren polimer kaplı cam tabanlı bir tabağa aktarın ve hücreleri serbest bırakmak için dokuyu mekanik olarak ayırın.

İnkübe edin, hücrelerin yapışmasına ve vestibüler bir ganglion nöron kültürü oluşturmasına izin verin.

Kapalı cerrahi makas kullanarak ötenazi yapılmış farenin beynini çıkarın. Beyni kafatasından tamamen ayırmak için kraniyal siniri kesin ve çıkarın. Başın arkasından başlayarak, şeffaf membranöz materyali forseps ile çekin ve ardından cerrahi makas kullanarak kafatasının üst kısmını kesin.

Diseksiyon alanını ve otik kapsülü daha temiz ve daha kolay erişilebilir hale getirmek için başın ve boynun arkasındaki fazla dokuyu çıkarın. Dokuyu taze L-15 çözeltisi ile ikinci bir Petri kabına aktarın. Ardından, otik kapsülü ve işitsel, superior vestibüler ve inferior vestibüler sinirleri bulun. Küçük yaylı makas kullanarak üst ve alt gangliyonları ayırın ve işitme sinirini kesin.

Bir neşter kullanarak, sinirin kemikli kapsüle daldığı kemikli bölgeyi zayıflatmak için kemikli sırtı nazikçe tıraş edin. Ganglionun tüm şişmiş kısmını açığa çıkaran bir neşter ile kalıntıları dikkatlice çıkarın.

Gangliyonu, utriküle doğru dalan periferik sinir dalından kesmek ve ayırmak için ince yaylı makası kullanın. İnce forseps kullanarak üstün ganglionu çıkarın ve taze L-15 çözeltisi ile 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın.

Enzim çözeltisini önceden ısıttıktan sonra, enzim karışımını 35 milimetrelik bir Petri kabına dökün ve 10 ila 15 dakika boyunca 37 derecelik bir inkübatöre koyun. Kemik, fazla doku, sinir lifleri ve diğer gereksiz yapıları çıkararak ganglionu ince forseps ve küçük yaylı makas kullanarak temizleyin. Herhangi bir ganglionik dokunun çıkarılmasını en aza indirmeye özen gösterin.

Temizlenmiş gangliyonları önceden ısıtılmış enzim çözeltisine aktarın ve 10 ila 40 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Daha sonra, gangliyonları taze L-15 çözeltisi ile 35 milimetrelik Petri kabına aktarın.

İki ila üç dakika sonra, gangliyonları filtrelenmiş kültür ortamı ile doldurulmuş başka bir 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. Yaklaşık 150 mikrolitre filtrelenmiş kültür ortamını kaplanmış bir cam tabanlı tabağa aktarın. Ardından, istenen sayıda ganglionu lamel üzerine aktarın.

Kültür kabından az miktarda kültür ortamı çekin ve dokunun cam pipetin kenarlarına yapışmasını önlemek için öğütme pipetini orta ile durulayın. Ganglionlar yeterince ayrışana kadar dokuyu pipetten nazikçe ve tekrar tekrar geçirerek tritürasyon yapın.

Beş dakika sonra, hücrelerin lamel üzerine yerleşip yerleşmediğini görmek için ışık mikroskobu altında kontrol edin. Bir kültür kabını 12 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre dikkatlice yerleştirin.