$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bir fare yavrusu korteksi alın.
Dokunun hücre dışı matrisini sindiren proteolitik bir enzim ekleyin. Daha sonra, hücreleri gevşeterek dokuyu mekanik olarak ayırın.
Kirletici DNA'yı parçalamak için glial ortam ve DNaz ekleyin.
Nöronları ve glial hücreleri serbest bırakmak için dokuyu mekanik olarak ayırın.
Sindirilmemiş doku çöktüğünde, hücreleri ve santrifüjü içeren ortamı toplayın. Süpernatanı çıkarın.
Glia ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve bunları hücre dışı matriks protein kaplı bir şişe üzerine yerleştirin.
Kuluçkaya yatmak. Astrositler, kaplanmış yüzeye diğer hücrelere göre daha güçlü bir şekilde yapışır. Glial media sadece glial hücre sağkalımını destekler.
Kalıntıları temizlemek için ortamı değiştirin.
Üstteki oligodendrosit öncü hücrelerini, OPC'leri ve mikroglia'yı ayırmak için çalkalama ile inkübe edin.
Ortamı hücrelerle birlikte bir kültür plakasına aktarın.
Diferansiyel mikroglial yapışmayı kolaylaştırmak için çalkalama ile inkübe edin.
Yapışmayan OPC süpernatanı poli-D-lizin kaplı çok kuyulu bir plakaya aktarın. OPC uyumu için kuluçkaya yatırın.
Medyayı OPC medyasıyla değiştirerek OPC'nin büyümesine izin verin.
Doku ile her tüpe 0.53 milimolar EDTA ile 1 mililitre% 0.05 tripsin ekleyin. Karışımı 10 mililitrelik bir pipetle yaklaşık 20 kez ezin. Ardından, hücre süspansiyonunu boş bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın.
Çözeltiyi 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 15 dakika inkübe edin, lizatları sekiz dakika sonra hafifçe çalkalayın. İnkübasyondan sonra, mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon için her tüpe 5 mililitre MGM ve 200 mikrolitre DNase-I ekleyin. Her lizatı 10 mililitrelik bir pipetle 10 kez ezin.
Daha sonra, ayrışmamış dokunun tüpün dibine yerleşmesine izin vermek için hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında üç dakika bekletilmesine izin verin. Hücre süspansiyonlarını yeni 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve ayrışmamış dokuyu geride bırakın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini 5 mililitre MGM'de yeniden süspanse edin ve 20 kez ezin.
Hücre süspansiyonlarını kaplanmış T-25 şişeleri üzerine yerleştirin ve hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Oligodendrosit öncü hücre izolasyonunu gerçekleştirmek için hücreleri 15 saat çalkalayın. Ardından, süpernatanı şişeden çıkarın ve steril bir Petri kabına koyun.
Süpernatanı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin, kalan mikrogliayı çıkarmak için 15 dakika sonra döndürün. Yapışmayan hücre süpernatantını çıkarın. Hücreleri sayın ve istenen konsantrasyonda poli-D-lizin kaplı bir yüzeye yerleştirin.
Hücreleri en az bir saat boyunca inkübatöre geri koyun. Ardından, ortamın %95'ini nazikçe aspire edin ve OPC'lerin bozulmasını en aza indirmek için kuyu duvarına pipetleyerek yavaşça ılık OPC ortamı ekleyin.