Bir Fare Embriyosundan Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü

Transgenik bir hamile fareyi alın ve floresan etiketli motor nöronlar içeren embriyolarla uterusu cerrahi olarak çıkarın.

Uterusu floresan mikroskobu altında buz gibi soğuk bir tampon içeren bir tabağa aktarın.

Embriyoları izole etmek için görünür ışık kullanın.

Embriyoların yüzünü ve kuyruğunu çıkarın ve yüzüstü pozisyona getirin.

Floresan sinyalini kullanarak, motor nöronları içeren okülomotor ve troklear çekirdekleri ortaya çıkarmak için orta beyinde bir kesi yapın.

Çekirdeği içeren orta beyni izole edin.

Arka beyin ve omuriliğin sırt tarafını açın. Omuriliği izole edin, her iki ucunu da eksize edin ve spinal motor nöronları içeren sütunları toplayın.

Doku matrisini ayırmak için toplanan dokuları enzimlerle tedavi edin. Tek hücreleri hasat edin ve FACS kullanarak floresan etiketli nöronları izole edin.

İzole edilen nöronlara bir kültür ortamı ekleyin, hücreleri kültür substratı kaplı bir mikroplaka üzerine aktarın ve hücrelerin yapışmasına ve büyümesine izin vererek inkübe edin.

Kültürdeki motor nöronları koruyun.

Döllenmeden yaklaşık 11.5 gün sonra hamile bir fareden Islet-1 EGF pozitif embriyoları toplayarak başlayın. Karnı etanol ile iyice püskürtün ve uterusu steril mikrodiseksiyon makası ve başparmak pansuman forseps ile çıkarın. Uterusu steril PBS'de kısaca yıkayın. Ardından, önceden soğutulmuş steril PBS ile doldurulmuş diseksiyon plakasına aktarın.

Mikroskobun parlak ışığı altında, mikrodiseksiyon makası, başparmak pansuman forsepsleri ve Dumont Number 5 cımbız kullanarak embriyoları uterustan dikkatlice çıkarın. Daha sonra, her bir embriyoyu 1X V27 ile desteklenmiş önceden soğutulmuş Hibernate E düşük floresan ortamı ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna aktarmak için steril bir Moria mini delikli Kaşık kullanın.

Plakayı buz üzerinde tutarken, bir embriyoyu steril bir diseksiyon plakasına aktarın ve buz gibi steril Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS ile tamamen kaplayın. Orta beyne zarar vermeden embriyonun yüzünü ve kuyruğunu çıkarmak için cımbız kullanın. Daha sonra, embriyoyu uzuvları üst üste binmiş ve kuyruğu mikroskobun önüne bakacak şekilde yüzüstü yerleştirin.

Küçük bir açıklık oluşturmak için dördüncü ventrikülün çatısını kesmek için cımbız kullanın. Dördüncü ventrikül ile çatısı arasında oluşturulan boşluğa cımbız asmak için bu açıklığı kullanın. Embriyo rostralının dorsal yüzeyi boyunca kortekse ve zemin plakasına ve motor kolonuna lateral olarak diseksiyon yapın.

Ardından, GFP pozitif CN3 ve CN4 çekirdeklerini ortaya çıkarmak için diseke edilen dokuyu açık kitap şeklinde açın. Ventral orta beyni embriyodan dikkatlice ayırın ve meningeal dokuyu cımbız ve mikrodiseksiyon bıçağıyla çıkarın.

Bilateral GFP pozitif CN3 ve CN4 çekirdeklerini zemin plakasından ve diğer GFP pozitif çevre dokulardan uzakta inceleyin, nöronlara dokunmaktan veya zarar vermekten kaçınmaya dikkat edin. Ayrı CN3 ve CN4 çekirdekleri topluyorsanız, bu iki çekirdeğin orta beynini kesin ve diseke ventral orta beyin dokusunu minimal HBSS ile toplamak için bir P1000 pipeti kullanın.

Diseksiyon ortamı ile doldurulmuş etiketli 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpü ayrışana kadar buz üzerinde saklayın. Toplam sayı deneysel gereksinimleri karşılayana kadar aynı tüpteki ek embriyolardan ventral orta beyinleri bir araya getirmeye devam edin.

Ventral omuriliği incelemek için, embriyoyu başı mikroskobun önüne bakacak şekilde yüzüstü tutun. Bir cımbızla tutun ve diğer çiftin ucunu dördüncü ventrikülün açılmamış kaudal kısmına yerleştirin. Arka beynin ve omuriliğin geri kalanını, embriyonun tüm rostrokaudal kapsamı boyunca dorsal olarak açın. Forsepsleri makas olarak kullanarak dördüncü ventrikülden başlayarak ve kaudal omuriliğin merkezi kanalına doğru ilerleyerek sırt dokusunu kesin.

Daha sonra, embriyoyu bir cımbız seti ile tutun ve diğer çift ile her iki taraftaki sırt dokusunun kanadını sıkıştırın. GFP pozitif SMN'nin hemen altını delmek için mikrodiseksiyon bıçağını kullanarak ventral omuriliği çıkarın, ventral omuriliği her iki tarafta testere benzeri hareketlerle kaldırın.

Omuriliği alt ekstremitenin üst sınırında enine kesin ve servikal bel kısmını çıkarın. İlk GFP pozitif ön boynuzun çıkıntı yaptığı C1'in hemen üzerinde enlemesine kesin. Ventral omurilik dorsal tarafını yukarı yerleştirin ve bir cımbızla GFP pozitif SMN kolonları arasındaki GFP negatif dokuya bastırarak tutun.

GFP pozitif SMN kolonunun her iki tarafını mikrodiseksiyon bıçağıyla keserek kalan bağlı mezenşimi, DRG'leri ve dorsal omuriliği çıkarın. Diseke ventral omurilik dokusunu minimal HBSS ile toplamak için bir P1000 pipeti kullanın ve diseksiyon ortamı ile doldurulmuş etiketli 1.7 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Ayrışana kadar buz üzerinde saklayın ve aynı tüpteki ek embriyolardan ventral omurilikleri birleştirmeye devam edin.

Diseke doku örnekleri ile mikrosantrifüj tüplerinin her birine uygun hacimde papain çözeltisi ekleyin. Tüpleri 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, tüpleri her 10 dakikada bir parmak hareketiyle çalkalayın.

İnkübasyondan sonra, her bir süspansiyonu bir P200 pipeti ile sekiz kez hafifçe ezin. Beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin. Hücre peletlerini uygun hacimde albümin ovomukoid inhibitör çözeltisi ile hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Ardından, süpernatanı bir P1000 pipeti ile dikkatlice çıkarın. Hücreleri uygun hacimde diseksiyon ortamında yeniden süspanse edin. Süspansiyonları 70 mikrometre hücre süzgeçlerinden süzün.

Ardından, CN3, CN4 ve SMN'den ayrılan GFP pozitif hücreleri izole etmek için FACS sıralamasını kullanın. İzole edilmiş hücre süspansiyonlarını, uygun yoğunluklara 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış motor nöron kültürü ortamı ile seyreltin ve 200 mikrolitre süspansiyonu PDL-laminin kaplı 96 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğuna ekleyin. Nöronları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörde kültürleyin ve motor nöron kültürü ortamını her beş günde bir yenilediğinizden emin olun.