İnsan Nöral Kök Hücrelerinin Nöral ve Astrosit Progenitörlerine Farklılaştırılması

Hücre kültüründen türetilmiş şartlandırılmış bir ortamda insan nöral kök hücrelerinin üç boyutlu bir toplamı olan yapışık olmayan nörosferlerle başlayın.

Bu ortam, hücre canlılığını koruyan besinleri, büyüme faktörlerini ve hücre dışı matris bileşenlerini içerir.

Nörosferleri toplamak için santrifüjleyin.

Onları tripsin ve DNaz enzimleri ile muamele edin, içeriği karıştırın ve ardından inkübe edin.

Tripsin, hücreden hücreye yapışmayı bozar ve hücre ayrılmasını kolaylaştırırken, DNaz, hücre topaklanmasını önlemek için serbest DNA'yı bozar.

Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için içeriği tekrar tekrar pipetleyin. Ardından, enzim aktivitesini nötralize etmek için bir tripsin inhibitörü ekleyin.

Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın ve ardından hücreleri nöral büyüme faktörleri içeren bir proliferasyon ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu, çok kuyucuklu bir plakaya yerleştirilmiş polimer kaplı bir lamel üzerine tohumlayın. Kök hücrenin polimere bağlanmasına izin vermek için inkübe edin.

Ayrıca, spesifik büyüme faktörlerinin emilmesine bağlı olarak, kök hücreler, özel hücre tiplerine daha fazla olgunlaşmaya hazır olan nöral ve astrosit progenitörlerine farklılaşır.

Kültür ortamını hazırladıktan ve insan nöral kök hücrelerini metin protokolüne göre kapladıktan sonra, inkübatörden geçilecek hücre şişesini alın ve biyogüvenlik kabinine veya BSC'ye getirin. Şişeyi yavaşça eğin ve hücrelerin havuzlanmış ortamın dibine batmasına izin verin.

10 mililitre ortamı, şartlandırılmış bir ortam için "CM" etiketli temiz 15 mililitrelik bir tüpe 5 mililitrelik iki porsiyona aktarın. Şişeye yerleşen hücrelerin hiçbirini aspire etmemeye dikkat edin. CM tüpünden 3 mililitre ortamı "tripsin inhibitör çözeltisi" etiketli 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ardından, CM tüpünü bir kenara koyun.

Ardından, T75 şişesinde kalan 5 mililitre ortamı ve hücreleri çıkarın ve "hücreler" etiketli 15 mililitrelik temiz bir tüpe yerleştirin. Daha sonra, serolojik bir pipet ve 3.5 mililitre hacimlerde CM kullanarak, T75 şişesini iki kez durulayın ve CM durulamasını 'hücreler' tüpüne aktarın. Bu, tüm nöroküreleri T75 şişesinden çıkaracaktır.

'Hücreler' tüpünü oda sıcaklığında 100 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. Hücreler dönerken, önceden hazırlanmış DPBS glikoz çözeltisini 37 santigrat derece su banyosundan alın ve uygun miktarda tripsin ve DNaz ekleyin.

'Hücreler' tüpü dönmeyi durdurduktan sonra, tüm şartlandırılmış orta süpernatanı çıkarın ve CM tüpüne aktarın. 15 mililitrelik tüpteki hücre peletine tripsin çözeltisi ekleyin ve yaklaşık 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetlemek için 5 mililitrelik bir pipet kullanın. Tüpün kapağını kapatın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin.

Tripsin inhibitörü tüpüne, tripsin çözeltisi için kullanılanla aynı hacimde çözelti ekleyerek uygun hacimde tripsin inhibitörü ekleyin. Ardından, tripsin inhibitör çözeltisini ihtiyaç duyulana kadar 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.

İnkübasyonun ardından, hücreleri 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, numuneyi 37 santigrat derece su banyosunda 10 ila 15 dakika daha inkübe edin. Hücre inkübasyonunu takiben, küreler tamamen ayrılana kadar hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyin. Ardından, hemen tripsin inhibitör çözeltisini ekleyin ve hücre süspansiyonunu 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Süspansiyondaki hücre sayısını saymak için, 15 mikrolitre tripan mavisi ön karışımını küçük bir tartı teknesine pipetleyin ve 5 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Karıştırmak için 3 ila 5 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, tripan mavisi hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini bir cam lamel ile kaplı bir hemositometrenin her iki tarafına aktarın.

Hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve dört köşe ızgarasının her birindeki toplam hücre sayısını sayın. Ardından, bu sayıları bir araya getirin. Metin protokolüne göre hücre sayısını hesapladıktan sonra, şişe başına 5 x 10⁶ hücre elde etmek için her bir T75 şişesine bir hacim hücre süspansiyonu ekleyin.

Hacim 5 mililitreden azsa, 5 mililitreye kadar ek şartlandırılmış ortam ekleyin. Ardından, şişeye büyüme faktörleri içeren 10 mililitre yeni DFHGFPS ortamı ekleyin. Şişenin hücre türü, tarihler, şişedeki hücre sayısı ve geçiş numarası ile etiketlendiğinden emin olun. İstenirse, hücreleri bu noktada inkübe edin.

Yapışan HNSC'leri plakalamak için, geçişten bir gün önce, BSC'yi metin protokolünde açıklandığı gibi temizleyin ve tek steril 12 milimetre cam lamelleri 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirmek için forseps kullanın. Kuyucukları, steril suda% 0.01 Poli-D-Lizin veya PDL oyukları başına 250 mikrolitre ile lamellerde kaplayın ve plakaları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. PDL'yi kuyucuklardan çıkarın ve ardından santimetre kare başına 1 mikrogram laminin DPBS ile kaplayın.

Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün gerekmezse, kapatmak için plakanın kenarlarına parafilm sarın ve 4 santigrat derecede saklayın. Fazla laminin çözeltisini aspirasyon yoluyla kuyucuklardan çıkarın ve kuyucukları bir kez durulamak için 0,5 mililitre DPBS kullanın. Daha sonra, hücreleri her bir kuyucuğa santimetre kare başına 0,6 ila 1 x 10⁵ hücre yoğunluğunda tohumlayın.