İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Ön Beyin Tipi Serebral Organoidlerin Üretilmesi

Bir Rho-kinaz inhibitörü ile desteklenmiş bir kök hücre ortamında insan kaynaklı pluripotent kök hücreler veya iPSC'ler içeren düşük bağlantılı bir kuyu plakası ile başlayın.

İnhibitörler hücrelere girer, Rho-kinaz enzimlerini bloke eder ve hücre canlılığını korur. Bu, iPSC agregalarının oluşumunu teşvik eder.

Agregaların büyümesine izin vermek için ortamı bir kök hücre ortamı ile değiştirin. Bunları kortikal indüksiyon ortamı ile düşük bağlantılı bir kültür kabına aktarın.

Bu ortamın bileşenleri, iPSC'lerin bir nöral öncü olan nöroektodermal hücrelere farklılaşmasına neden olur.

Her nöroektodermal agregayı sığ kuyucuklara sahip bir filme aktarın.

Ortamı bir bazal membran matrisi ile değiştirin ve matrisin katılaşmasına ve agregaların sıkışmasına izin vermek için inkübe edin.

Bu matrise gömülü agregaları kortikal indüksiyon ortamı içeren bir tabağa aktarın ve çalkalama ile inkübe edin.

Zamanla, nöroektodermal hücreler farklılaşma faktörlerini kullanır ve nöroepitel hücrelerine dönüşür.

Ortamı, hücrelerin daha özel hücre tiplerine olgunlaşmasına izin veren ve ön beyin korteksine benzeyen bir serebral organoid oluşturan bir organoid farklılaşma ortamına değiştirin.

Pluripotent kök hücre agregatları oluşturmak için, kök hücre kültürleri %70 ila %90 birleşime ulaştığında, hücreleri ayırmak için altı oyuklu kültür plakasının bir oyuğuna 500 mikrolitre hücre ayrışma reaktifi ekleyin.

Tek tabakalı kültür koşullarına adapte edilmiş indüklenmiş pluripotent kök hücreler, ayrışma ve agregasyon prosedürü sırasında strese bağlı hücre ölümüne daha az eğilimli oldukları için agrega oluşturmak için iyi bir hücre tipidir.

37 santigrat derecede 5 ila 10 dakika sonra, plakaya hafifçe vurun ve hücreleri kuyu dibinden yıkamak için 2 mililitre DMEM / F-12 kullanın. Elde edilen hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücre çözeltisinin hacmini daha fazla DMEM / F-12 ortamı ile 10 mililitreye getirin.

Saydıktan sonra, pluripotent kök hücre agregatı başına 4.5 kez 10 kez üçüncü hücrelere 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Peletleri, 150 mikrolitre orta konsantrasyonda 4.5 x 10³ hücre elde etmek için 50 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş uygun hacimde pluripotent kök hücre ortamında yeniden süspanse edin.

Daha sonra, 96 oyuklu düşük bağlantılı bir U-tabanlı plakanın ayrı kuyucuklarına 150 mikrolitre hücre ekleyin ve plakayı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatöre yerleştirin. Anterior nöroektoderm indüksiyonunu izlemek için, pluripotent kök hücre agregatlarının morfolojik değişikliklerini her gün düşük büyütme altında yakından gözlemlemek için bir doku kültürü mikroskobu kullanın.

1. günde, net sınırları olan hücre agregaları gözlenmelidir. 2. günde, her bir oyuğun dibindeki hücre agregalarını bozmadan ortamın yaklaşık 2 / 3'ünü dikkatlice aspire edin ve atılan ortamı 100 mikrolitre taze pluripotent kök hücre ortamı ile değiştirin.

Dört ila altı gün sonra, hücre agregaları 350 ila 450 mikrometre çapa ulaştığında ve pürüzsüz kenarlar sergilediğinde, 20 adede kadar agregayı 5 mililitre kortikal indüksiyon ortamı içeren tek bir 6 santimetrelik düşük bağlantılı kültür plakasına aktarmak için modifiye edilmiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.

Kortikal indüksiyon ortamını her üç günde bir taze ortamla değiştirin ve agregaların morfolojisini 4x hedef altında günlük olarak izleyin. Kortikal indüksiyon ortamında dört ila beş gün sonra, hücre agregatlarının kenarları yüzeyde parlamaya başlamalı, bu da nöroektodermal farklılaşmayı göstermeli ve psödostratifiye bir epitelin radyal organizasyonu ortaya çıkmalıdır.

Nöroektodermal agregaları bir matris iskelesine gömmek için, bir bazal membran ekstraktını iki ila üç saat boyunca buz üzerine doldurun. Ekstrakt çözülürken, plastik parafin filmi 16 organoid başına 4 x 4 santimetre kareye kesmek için steril makas kullanın ve her bir film parçasını boş bir 100 mikrolitrelik mikropipet ucu tepsisine yerleştirin.

Parafin filmine eldivenli bir parmak ucunuzla küçük çukurlar görünecek şekilde bastırın ve filmi %70 etanol ile temizleyin. 30 dakika boyunca kapalı, steril bir biyogüvenlik kabininde UV ışınlamasından sonra, her bir hücre agregasını filmdeki bir çukura aktarmak için 1 ve 1/2 ila 2 milimetre açıklığa sahip modifiye edilmiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.

Tüm agregalar aktarıldığında, ortamı her çukurdan dikkatlice aspire etmek için kesilmemiş 100 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın ve her hücre agregasına 40 mikrolitre seyreltilmemiş bazal membran özü ekleyin.

Gelişmekte olan nöroepitele zarar vereceğinden, pipet ucuna kaba manipülasyon veya aspirasyon yoluyla organoidlere zarar vermemeye dikkat edin.

Agregaları her damlanın ortasına yerleştirmek için pipet ucunu kullanın ve plastik parafin film tabakasını dikkatlice 10 santimetrelik bir Petri kabına aktarmak için steril forseps kullanın. Çanağı 15 ila 20 dakika inkübatöre yerleştirin.

Ekstrakt katılaşırken, altı santimetrelik düşük bir ataşman kültürü kabına 5 mililitre taze kortikal indüksiyon ortamı ekleyin. Kuluçka işleminin sonunda, parafin film tabakasını ters çevirin ve her 6 santimetrelik tabağa 16 polimerize damlacığı hafifçe sıkmak için steril forseps kullanın. Ardından, agregaları hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Ertesi gün, organoid kültür kaplarını, agregalar ilgilenilen farklılaşma aşamasına ulaşana kadar günlük ışık mikroskobu izleme ile bir hücre kültürü inkübatörü içinde 14 RPM'de 5 derecelik bir açıyla eğilmiş sallanan bir hücre kültürü çalkalayıcısına aktarın.