JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:52 dk • July 8th, 2025
Nöral krest hücrelerinden veya NCC'lerden türeyen floresan protein eksprese eden adipoz türevi kök hücreler içeren hasat edilmiş transgenik fare periaortik yağ dokularını alın.
Sindirim ortamı ekleyin ve dokuları kıyın.
Kıyılmış dokuyu sindirim ortamı ile bir tüpe aktarın. Parçaları mekanik olarak ayırın.
Kuluçkaya yatmak. Ortamdaki kollajenaz, dokunun hücre dışı matrisini sindirerek kök hücreleri, adipositleri ve fibroblastları serbest bırakır.
Kollajenaz aktivitesini durdurmak için serum içeren ortam ekleyin. Süpernatan içeren adipositleri santrifüjleyin ve atın.
Ortamdaki hücreleri yeniden askıya alın ve agregaları çıkarmak için filtreleyin.
Süzüntüyü santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Eritrositleri parçalamak için eritrosit lizis tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin.
Lizizi durdurmak için serum içeren tampon ekleyin. Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.
Tampondaki hücreleri yeniden askıya alın.
Floresan kök hücreleri izole etmek için floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması yapın.
İzole edilen kök hücreler daha ileri deneyler için kullanılabilir.
Hasat edilen yağ dokusunu, 1 mililitre taze hazırlanmış sindirim ortamı içeren yeni bir 2 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dokuları kıymak için cerrahi makas kullanın. Doku bulamacını 9 mililitre taze sindirim ortamı içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dokuları 10 kez ezmek için 1 mililitrelik bir pipet kullanın.
Homojen bir çözelti elde edildiğinde, tüpü 37 santigrat derecede ve dakikada 100 devirde 30 ila 45 dakika inkübe edin ve aşırı sindirimi önlemek için her 5 ila 10 dakikada bir kontrol edin. Tüpün hafifçe döndürülmesi üzerine açık sarı homojen bir yağ dokusu çözeltisi gözlendiğinde,% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 5 mililitre HDMEM ile sindirimi durdurun. İyice karıştırdıktan sonra, yağ dokusu örneğini santrifüjleyin.
Stromal vasküler hücre fraksiyonu kahverengimsi bir topak olarak görünecektir. Peleti 10 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün.
Hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve peleti 5 mililitre eritrosit lizis tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 15 milimetrelik bir tüpe aktarın. 10 dakika sonra,% 1 fetal sığır serumu ile desteklenmiş 10 mililitre PBS'de iki santrifüjleme ile reaksiyonu durdurun.
İkinci santrifüjlemeden sonra, peleti buz üzerinde 5 mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri son bir santrifüjleme ile toplayın. Ardından, hücreleri saymak için 5 mililitre FACS tamponunda yeniden askıya alın.
Standart protokollere göre FACS tarafından izole edildikten sonra bir NCADSC kültürü kurmak için, hücreleri her bir oyuğa cm başına 5 x 103 hücre2 konsantrasyonuna, tam kültür ortamında 12 oyuklu bir kültür plakasına, 37 santigrat dereceye ve 20 ila 24 saat boyunca% 5 karbondioksite yerleştirin. Ertesi gün, hücreleri 37 Santigrat PBS ile yıkayın ve kültürü taze kültür ortamı ile besleyin.
Bu makale, fare periaortik yağ dokusundan nöral krista kaynaklı yağ dokusu kökenli mezenkimal kök hücrelerin (NCADSC'ler) izolasyonu, kültüre edilmesi ve adipojenik farklılaşmasının indüklenmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu yöntem, nöral krista hücrelerinde floresan proteinler eksprese eden transgenik fareleri kullanarak, NCADSC'lerin sonraki uygulamalar için hassas bir şekilde tanımlanmasını ve ayrıştırılmasını sağlamaktadır.
Fare periaortik adipöz dokudan nöral krista kaynaklı adipöz kaynaklı kök hücrelerin (NCADSC'ler) izole edilmesi, metabolik ve vasküler hastalık modellerinde hedef doğrulamasına olanak tanır. Floresan etiketleme ve FACS saflaştırması, kök hücre tedavilerinin mekanistik risklerinin azaltılması için tekrarlanabilir bir sistem sağlar. Bu yaklaşım, hücresel homojenliği ve soy izlenebilirliğini sağlayarak preklinik taramalarda öngörü güvenini destekler.
İzolasyon iş akışı, erken keşiften preklinik geçiş aşamasına kadar uyum sağlayarak, aşağı yönlü fonksiyonel doğrulama ve öncü bileşik tanımlama çalışmaları için tanımlanmış bir hücresel girdi sağlar.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 22 Ağustos 2026