Bir farenin submukoza ve lamina propriasından enterik glial hücrelerin izole edilmesi

Daha önce uzunlamasına kas ve myenterik pleksus, enterik nöronlar içeren katmanlar ve glial hücrelerden sıyrılmış bir fare ince bağırsak segmentini ele alalım.

Dokuyu kesin ve EDTA içeren bir tampona yerleştirin. Sallanarak kuluçkaya yatırın.

EDTA, epitel mukozasını altta yatan lamina propria ve submukozadan, enterik glial hücreler içeren bağ dokusu katmanlarından ayırarak hücre-hücre bağlantılarını bozar.

Epitel hücrelerini çıkarmak için tekrar tekrar pipetleyin.

Bir hücre süzgecinden süzün ve akışı atın.

Dokuyu enzimatik olmayan bir ayrışma tamponuna aktarın ve sallanarak inkübe edin. Ayrışma tamponu, lamina propria'yı ve submukozal hücre dışı matrisi gevşeterek hücreleri ayırır.

Hücreleri daha fazla ayırmak için tekrar tekrar pipetleyin.

Hücreleri toplamak için bir hücre süzgecinden süzün.

Hücreleri bir tamponda santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin.

Glial bir büyüme ortamı içeren yapışma proteini kaplı kuyucukları alın ve hücreleri plakalayın.

Kaplama, hücre yapışmasını kolaylaştırırken, büyüme faktörleri seçici olarak glial hücre proliferasyonunu teşvik ederek bir lamina propria ve submukozal glial hücre kültürü oluşturur.

Epitel mukozasını çıkarmak için önce ince makas kullanarak bağırsakları yaklaşık 0,5 santimetrelik parçalara ayırın ve parçaları 30 mililitre buz gibi EDTA/HEPES/DPBS solüsyonunda toplayın. Doku içeren solüsyonu 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca dakikada yaklaşık 60 eğimle sallayın.

EDTA/HEPES/DPBS tamponunu bir kez yukarı ve aşağı pipetleyerek 5 mililitrelik bir plastik pipeti önceden nemlendirin ve ardından dokuyu ezmek için önceden nemlendirilmiş pipeti kullanın ve epitel mukozasını çıkarmak için süspansiyonu 20 kez tamponlayın.

Karışımı 100 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden dökerek dokuyu toplayın ve süzgeçte tutulan dokuyu 30 mililitre buz gibi soğuk EDTA/HEPES/DPBS içeren 50 mililitrelik yeni bir konik santrifüj tüpüne yerleştirmek için iğne burunlu forseps kullanın. Ek epitel mukozasını çıkarmak için dokuyu 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca dakikada yaklaşık 60 eğimde sallayarak EDTA / HEPES / DPBS inkübasyonunu ikinci kez tekrarlayın.

Önceden nemlendirilmiş 5 mililitrelik bir pipet kullanarak hafif bir öğütme işlemi gerçekleştirin. Epitelin daha fazlası çıkarıldıkça doku pipetin içine yapışma eğiliminde olacaktır.

Enterik glial hücreler daha kırılgan olduğu için bu noktada hafif öğütme gereklidir.

İkinci inkübasyondan sonra karışımı 100 mikronluk bir naylon hücre süzgecinden dökerek dokuyu toplayın ve akışı atın. İkinci akış, birinciden belirgin şekilde daha az bulanık olmalıdır. Çözelti neredeyse berraklaşana kadar 10 dakikalık EDTA inkübasyonlarını tekrarlayın.

Dokuyu naylon süzgeçten 5 mililitre ticari olarak temin edilebilen hücre geri kazanım solüsyonu içeren 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, 4 santigrat derecede 25 ila 30 dakika sallayın. Enterik glial hücreleri lamina propriadan ayırmak için 10 kez hafifçe ezin, daha sonra 40 mikronluk bir filtreden süzün ve süzüntüyü temiz 50 mililitrelik bir tüpe toplayın.

Naylon filtredeki dokuyu 1 mililitre DPBS ile durulayın. Dokuyu atın ve 5 ila 6 mililitre süzüntüyü temiz bir 15 mililitre konik santrifüj tüpüne aktarın. Süzüntüyü, 4 santigrat derecede beş dakika boyunca sallanan bir kova santrifüjünde 2.000 kez g döndürün.

Glial hücre içeren peleti en az 1 mililitre yeniden süspansiyon tamponu içinde yeniden süspanse ederek, peleti 500 mikrolitrelik pipet ucuyla kabarcıklar oluşturmadan hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Son olarak, laminin kaplı 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre hücre süspansiyonu veya glial büyüme ortamı içeren 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre ekleyerek enterik glial hücreleri plakalayın.