Domuz beyninden kılcal damarların temizlenmesi
JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:45 dk • July 8th, 2025
Bir domuz beyni alın.
Meningeal hücre kontaminasyonunu önlemek için beyni kaplayan koruyucu zar olan meninksleri çıkarın.
Kılcal damarlar açısından zengin bir bölge olan gri maddeyi kazıyın ve dokuyu ortam içeren bir kültür kabında toplayın.
Dokuyu parçalamak için gri maddeyi iğnesiz bir şırıngadan geçirin.
Parçaları bir homojenizatöre aktarın ve dokuyu daha fazla parçalamak için homojenize edin ve beyin kılcal damarlarını serbest bırakın.
Kılcal damarları tutmak için homojenatı belirli bir gözenek boyutuna sahip bir filtreden geçirin ve diğer beyin hücrelerinin akmasına izin verin.
Filtreyi enzimler ve DNaz içeren bir çözeltiye yerleştirin.
Enzimler yapışık hücreleri ayırırken, DNaz kirletici DNA'yı parçalayarak saf kılcal damarların izolasyonunu kolaylaştırır.
Kılcal damarları filtreden yıkayın.
Enzimleri inaktive etmek için serum proteinleri içeren ortam ekleyin.
Kılcal damarları bir tüpe, santrifüje aktarın ve süpernatanı çıkarın. Daha fazla analiz için saf kılcal damarları taze ortamda yeniden süspanse edin.
Bu işleme başlamak için, beyinleri steril bir akış tezgahına yerleştirin ve buz üzerine yerleştirilmiş bir beherde 1 litre PBS ile nazikçe yıkayın. Daha sonra, ince uçlu forseps kullanarak meninksleri her beyinden dikkatlice çıkarın. Bir neşter kullanarak, beyindeki gri maddeyi teker teker kazıyın ve izole edilen materyali buz üzerine yerleştirilmiş 20 mililitre DMEM / F12 içeren Petri kaplarına aktarın.
İlk parçalanma için, gri madde malzemesini iğne olmadan 50 mililitrelik bir şırıngadan geçirin. Prosedürü tüm beyinler için tekrarlayın ve toplanan gri madde materyalini bir araya getirin. İzole edilmiş gri madde malzemesini DMEM/F12 ortamı ile el tipi bir doku homojenizatörünün öğütücü tüpüne aktarın. Gevşek bir havaneli ile 8 yukarı ve aşağı vuruş yaparak, ardından sıkı bir havaneli ile 8 yukarı ve aşağı vuruş yaparak malzemeyi homojenize edin.
Ardından, filtre tutuculu ve 140 mikron filtre ağlı 500 mililitrelik mavi kapaklı bir şişe kullanarak homojenatı filtreleyerek kılcal damarları izole edin. Kılcal içeren filtreleri sindirim solüsyonu ile Petri kaplarına yerleştirin. Daha sonra, Petri kaplarını 180 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin veya her 10 dakikada bir hafifçe karıştırın.
Bir saat sonra, kılcal damarları filtrelerden Petri kabından süspansiyon ile yıkayın. Ardından, süspansiyonu üç tabaktan iki adet 50 mililitrelik tüpe bölün ve her 50 mililitrelik tüpe 10 mililitre DMEM / F12 ekleyerek sindirimi durdurun.
Hücre süspansiyonlarını 250 kez g, 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanları aspire edin ve her peleti 10 mililitre DMEM / F12 içinde yeniden süspanse edin. Ardından, her tüpe 20 mililitre DMEM / F12 daha ekleyin.
Genel Bakış
Bu makale, in vitro bir kan-beyin bariyeri (BBB) modeli oluşturmak için taze domuz beyinlerinden kapillerlerin izole edilmesine yönelik geliştirilmiş bir protokol sunmaktadır. Yöntem; ileri analizler veya hücre kültürü uygulamaları için uygun, saf beyin kapillerleri elde etmek amacıyla meningeslerin dikkatle uzaklaştırılmasına, hassas doku işlemine ve enzimatik sindirime vurgu yapmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Kan-Beyin Bariyeri Araştırmaları
Arka Plan
- Kan-beyin bariyeri, kan dolaşımı ile beyin arasındaki moleküler değişimi düzenleyen kritik bir yapıdır.
- In vitro KBB modelleri, bariyer fonksiyonunu ve ilaç geçirgenliğini çalışmak için gereklidir.
- Domuz beyin endotel hücreleri, insan KBB ile fizyolojik benzerlikleri nedeniyle yaygın olarak kullanılır.
- Beyin kılcal damarlarının etkin izolasyonu, güvenilir KBB modelleri oluşturmak için ön koşuldur.
Çalışmanın Amacı
- Domuz beyinlerinden kapillerleri izole etmek için ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir yöntemi göstermek.
- Kapiller olmayan hücrelerden kaynaklanan kontaminasyonu minimize etmek ve kapiller verimini maksimize etmek.
- Ardıl BBB model kurulumu ve analizi için uygun bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- İnce uçlu pensler kullanılarak taze domuz beyinlerinden meningeslerin uzaklaştırılması.
- Kılcal damarlarca zengin gri cevherin sıyrılıp soğuk kültür ortamına toplanması.
- Bir şırınga ve doku homojenizatörü kullanılarak gri cevherin mekanik olarak parçalanması.
- Kılcal damarları izole etmek için homojenatın 140 mikronluk bir süzgeçten filtrelenmesi.
- Kılcal damarları saflaştırmak, yapışık hücreleri ve DNA'yı uzaklaştırmak için enzimler ve DNase ile enzimatik sindirim.
- Kılcal damarların yıkanması, santrifüj edilmesi ve taze ortamda yeniden süspande edilmesi.
Temel Sonuçlar
- Porcine dokusundan saf beyin kılcal damarlarının verimli izolasyonu.
- Menenjeal ve diğer kapiller olmayan hücrelerden kaynaklanan kontaminasyonun minimize edilmesi.
- İleri analizler veya in vitro BBB modellerinde kullanım için uygun kılcal damarlar.
- Protokol, birden fazla beyin için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilirdir.
Sonuçlar
- Açıklanan yöntem, porcine beyin kılcal damarlarının izole edilmesi için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır.
- Dokunun dikkatli işlenmesi ve enzimatik sindirim, saflık ve verim için temel öneme sahiptir.
- Bu protokol, araştırma uygulamaları için güçlü in vitro BBB modellerinin geliştirilmesini desteklemektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektör Alakası
Domuz beyin kapillerlerinin güvenilir şekilde izole edilmesi, MSS ilaç keşfi için kritik bir dönüm noktası olan sağlam in vitro kan-beyin bariyeri (BBB) modellerinin geliştirilmesinin temelini oluşturur. Yüksek saflıktaki kapiller preparasyonlar, bileşik geçirgenliğinin öngörücü değerlendirmesine ve sürecin erken aşamalarında mekanik risklerin azaltılmasına olanak tanır. Bu yetkinlik, nöroterapötik programlar için translasyonel sürekliliği ve portföy önceliklendirmesini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Fizyolojik olarak ilgili kapiler yapıları kullanarak KKB taşıma mekanizmalarının incelenmesine olanak tanır.
- Otantik endotel substratlar sağlayarak MSS ilaç hedeflerinin fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Kontrollü geçirgenlik çalışmaları yoluyla aday moleküllerin mekanistik risk azaltma süreçlerini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Tekrarlanabilir in vitro KKK model kurulumu için standardize edilmiş kılcal damar kaynağı sağlar.
- Bileşiklerin KKK boyunca penetrasyonunun ve eflluksunun kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- MSS aktif bileşiklerinin yüksek kapasiteli taraması için analiz ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Domuz kaynaklı kılcal damarlar kullanarak, in vitro KKB modellerini hastalıkla ilgili insan fizyolojisiyle uyumlu hale getirir.
- MSS ilaç adaylarının erken keşif aşamasından preklinik doğrulamasına kadar olan sürecin sürekliliğini sağlar.
- Öngörücü geçirgenlik verileri sağlayarak riskle uyumlu ilerleme kararlarını destekler.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu kapiler izolasyon protokolü, erken keşif ile analiz geliştirme aşamaları arasındaki ara noktada konumlandırılarak, sonraki süreçlerdeki KKB modelleme ve bileşik tarama iş akışlarına olanak sağlar.
- Keşif Biyolojisi: KKB transportu ve hedef etkileşiminin hipotez testleri için yüksek saflıkta kapilerler sağlar.
- Tarama: Kantitatif geçirgenlik ve eflluks analizleri için tekrarlanabilir biyolojik substratlar sunar.
- Analitikler: İzole kapilerler kullanılarak bileşik geçişinin ve bariyer bütünlüğünün ölçümünü destekler.
- Translasyonel Araştırma: Fizyolojik uygunluğu koruyarak in vitro bulguları preklinik modellerle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Programlar genelinde tekrarlı KKB model üretimi için ölçeklenebilir ve standartlaştırılmış bir protokol oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: KKB geçirgenliği ve hedef doğrulama çalışmalarındaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: KKB model hazırlığının tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu geliştirir.
- Stratejik Değer: MSS portföy varlıkları için karar verme (go/no-go) kalitesini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Erken bariyer verilerine dayanarak nöroterapötik adaylarının riskle uyumlu önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Doku diseksiyonu, enzimatik sindirim ve steril teknik konusunda teknik uzmanlık gerektirir.
- Homojenizörlere, filtrasyon düzeneklerine ve kontrollü inkübasyon ekipmanlarına erişim gerektirir.
- Doku işlemleri ve kapiller saflaştırma adımlarında ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Araştırma odağına bağlı olarak farklı türler veya beyin bölgeleri için adaptasyon gerekebilir.
- Verim ve saflık, doku kalitesinden ve prosedürel tutarlılıktan etkilenir.
Biyofarma SSS
İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu
İlgili videolar
0 Görüntüler
Willis Fare Çemberi Ayırma Protokolü
İlgili videolar
0 Görüntüler
Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller
İlgili videolar
0 Görüntüler
Primer Beyin Perisitlerinin İzolasyonu ve Kültürü: Endotel Hücre Kontaminasyonu Olmadan Sığır Beyin Kılcal Damarlarından Perisitleri İzole Etme ve Kültür Prosedürü
İlgili videolar
0 Görüntüler
Serebral Kılcal Damarların İnsan Beyninden İzolasyonu: İnsan Beyin Dokusundan Serebral Kılcal Damarları Çıkarmak İçin Optimize Edilmiş Bir Yöntem
İlgili videolar
0 Görüntüler
Fare Beyin Gemiler saflaştırılması
İlgili videolar
0 Görüntüler
Histolojik Analiz Domuz MSS Pozlama: Decapitation, Kafatası Açılış İçin El Kitabı ve Beyin Kaldırma
İlgili videolar
0 Görüntüler
Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş
İlgili videolar
0 Görüntüler
Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon
İlgili videolar
0 Görüntüler
Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 22 Ağustos 2026