JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 3:28 dk. • July 8th, 2025
Beynin en dış tabakası olan sıçan kortikal beyin dokusunu içeren soğuk bir cam havan ile başlayın.
Proteaz inhibitörleri içeren bir beyin mikrodamar tamponu veya BMB ekleyin.
Şimdi, dokuyu ayırmak için havaneli yukarı ve aşağı hareket ettirin.
Bu ajitasyon, mikro damarlar, perisitler, nöronlar ve glial hücrelerden oluşan nörovasküler birimleri veya NVU'ları serbest bırakır. Proteaz inhibitörleri, salınan proteazları bloke ederek mikro damarları korur.
Bu karışımı bir tüpe aktarın.
Yoğun bir polisakkarit çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi diğer içeriklerle eşit şekilde karıştırmak için bir girdap kullanın.
merkezkaç. Yoğun polisakkaritler, doku kalıntılarından daha yoğun olan NVU'ların sedimantasyonuna izin verir.
Süpernatanı atın ve proteaz inhibitörü ve polisakkarit çözeltisi içeren BMB'deki NVU'ları yeniden süspanse edin.
İçeriği karıştırmak için girdabı kullanın.
Santrifüjleme işlemini tekrarlayın. Kalan kalıntıları temizlemek için süpernatanı atın.
NVU'ları BMB'de yeniden askıya alın ve daha fazla analiz için saklayın.
Kortikal beyin dokusunu soğutulmuş bir cam havan içine yerleştirin. Ardından, proteaz inhibitörü kokteyli ile 5 mililitre BMB ekleyin. Üstten güçlü bir homojenizatör kullanarak, harcın içine bir havan tokmağı yerleştirin ve 3.700 RPM'de 15 yukarı ve aşağı vuruş kullanarak beyin dokusunu homojenize edin. Daha sonra homojenatı etiketli santrifüj tüplerine dökün. Numuneler arasında, havaneli temizlemek için% 70 etanol kullanın.
Santrifüjleme yapmak için, beyin homojenatı içeren etiketli her bir santrifüj tüpüne 8.0 mililitre% 26 dekstran çözeltisi ekleyin. Tüpü iki kez ters çevirin ve ardından numuneyi iyice girdaplayın. Beyin homojenat çözeltisinin% 26 dekstran çözeltisi ile iyice karıştırılmasını sağlamak için her bir numunenin girdaplanmasını birden fazla açı kullanarak gerçekleştirin. Numuneleri 5.000 g ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı aspire edin ve peleti proteaz inhibitör kokteyli ile 5.0 mililitre BMB'de yeniden süspanse edin. Ardından, iyice karıştırmayı sağlamak için peleti girdaplayın. Daha sonra, her bir santrifüj tüpüne 8.0 mililitre% 26 dekstran ekleyin ve az önce gösterildiği gibi girdap yapın. Ardından numuneleri tekrar santrifüjleyin.
Bir vakum şişesi ve cam pipet kullanarak, süpernatanı aspire edin ve beyin mikro damarını içeren peletin bozulmadığından emin olun. Peleti BMB'de proteaz inhibitörü ve ardından iki kez daha %26 dekstran ile yeniden süspanse edin. Son santrifüjlemeden sonra, numuneyi yeniden süspanse etmek için her pelet ve girdaba 5.0 mililitre BMB ekleyin.