Nöronal Kültürler için Dorsal Kök Gangliyonlarının Toplanması ve Ayrıştırılması için Bir Teknik

Bir sıçanın omurgasının bir bölümünü alın ve omuriliği çıkarmak için bölün.

Uydu glial hücreler veya SGC'ler ile çevrili bir nöron kümesi olan dorsal kök gangliyonlarını veya DRG'leri ayırın.

DRG'leri bir büyüme ortamına yerleştirin. SGC kontaminasyonunu azaltmak için sinir köklerini çıkarın.

Doku matrisini bozmak için kollajenaz ile muamele edin ve enzimleri çıkarmak için yıkayın.

Hücreler arası bağlantıları bozmak için tripsin ekleyin. Tripsini etkisiz hale getiren proteinler içeren bir serum ekleyin.

Büyüme ortamını ekleyin ve dokuyu mekanik olarak ayırın. Tek hücreleri izole etmek için süspansiyonu filtreleyin ve doku kalıntılarını gidermek için santrifüjleyin.

Hücreleri bir yoğunluk gradyan ortamı ve santrifüj üzerine katmanlamak için yeniden askıya alın.

Daha yüksek yoğunluğa sahip nöronlar dibe çökerek SGC'lerin ayrılmasını kolaylaştırır.

Nöronları bir kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bunları, hücre bağlanmasına izin verecek şekilde kültür substratı kaplı bir kuyuya aktarın.

Nöronal sağkalım için sinir büyüme faktörleri ile takviye.

Omuriliği topladıktan sonra DRG nöronlarını elde etmek için, herhangi bir sırt parçasını çıkararak başlayın ve ardından omurgayı uzunlamasına eksen boyunca ikiye bölmek ve kordon dokusunu açığa çıkarmak için steril ve keskin cerrahi makas kullanın. Omurgayı göğüs kafesi seviyesinin altında iki küçük parçaya kesin ve ardından tüm kordon dokusunu nazikçe çıkarmak için ince forseps kullanın, doğrudan kanallardan çıkan beyaz filamentler gibi görünen DRG köklerini çekip çıkarmamaya dikkat edin.

Çekirdek dokunun tamamı çıkarıldıktan sonra, tüm DRG kökünü çekmek için çok ince forseps kullanın, vertebral kanalların derinliklerine ulaşın ve ganglionların köklerine zarar vermemeye dikkat edin. DRG'yi, antibiyotiklerle desteklenmiş 3 ila 4 mililitre Ham's F-12 ortamı içeren 60 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, uydu hücrelerinin kontaminasyonunu azaltmak için gangliyonları çevreleyen fazla sinir köklerini temizlemek için steril forseps ve bir neşter kullanın.

Daha sonra, DRG'yi 1.8 mililitre taze F-12 ortamı içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın ve 200 mikrolitre kollajenaz tip-4 stok çözeltisi ekleyin. DRG'yi bir saat inkübe edin ve ardından DRG'yi aspire etmemeye veya zarar vermemeye dikkat ederek ortamı bir cam pipetle dikkatlice aspire edin.

Kollajenaz adımını tekrarlayın ve DRG'yi F-12 ortamı ile yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, hücrelere 1.8 mililitre F12 ortamı ve 200 mikrolitre tripsin ekleyin, tripsini çıkarın ve enzimatik reaksiyonu durdurmak için 500 mikrolitre FBS ile takviye edilmiş 1 mililitre ortam ekleyin. Ardından, ortamı aspire edin ve serumun tüm izlerini gidermek için DRG'yi F-12 ortamı ile üç kez nazikçe yıkayın.

Şimdi, hücreleri 2 mililitre taze F-12 ortamı ile besleyin ve hücre süspansiyonunu dikkatlice 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için bir cam pipet kullanın. Nöronları nazikçe ayırmak için 8 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından peletin tüpün dibinde birikmesine izin verin. Pelet çöktüğünde, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve pelete 2 mililitre taze F12 ortamı ekleyin, süspansiyon homojen hale gelene kadar mekanik ayrışmayı ve ortam transferini tekrarlayın.

Daha sonra, hücre süspansiyonunu üç ila dört kez ezin, ardından elde edilen homojenize süspansiyonun 100 mikronluk bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mililitrelik tüpe süzülmesi ile devam edin. Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpte santrifüjleyin. Dönerken, taze hazırlanmış% 15 sığır serum albüminini 45 derecelik bir açıyla tutulan 15 mililitrelik bir tüpün içine yavaşça pipetleyin ve tüp üzerindeki sayıları şekillendirme yolu için referans olarak kullanarak kademeli bir protein izi oluşturun.

Daha sonra, süpernatanı hücrelerden aspire edin, son 500 mikrolitreyi peleti yeniden süspanse etmek için saklayın ve hücreleri protein izi boyunca yavaşça yeni tüpe dağıtın. Hücreleri tekrar döndürdükten sonra, peleti 1 mililitre modifiye BS ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri iki saat boyunca 24 oyuklu bir plakada küçük bir hacimde tohumlayın. Hücreler bağlandığında, mililitre sinir büyüme faktörü başına 50 nanogram ile takviye edilmiş taze BS ortamı ekleyin.