Erişkin Bir Sıçanın Omurilik Periventriküler Bölgesinden Nöral Kök Progenitör Hücrelerin İzolasyonu

JoVE Encyclopedia of Experiments

Sinirbilim

0 görüntüleme • 4:30 dk • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral kök / progenitör hücreler açısından zengin bir bölge olan yetişkin bir sıçanın omurilik periventriküler dokusu ile başlayın.

Dokuyu papain ve DNaz içeren bir çözeltiye aktarın.

Proteolitik bir enzim olan patain, dokunun hücre dışı matrisini parçalarken, DNaz, hasarlı hücrelerden salınan kontamine DNA'yı bozar.

Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için dokuyu mekanik olarak ayırın.

Süspansiyonu bir tüpe aktarın ve santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Hücreleri, albümin proteini ve bir proteaz inhibitörü içeren bir çözelti içinde yeniden süspanse edin.

Albümin ve inhibitör papain'i devre dışı bırakır.

Hücre süspansiyonunu albümin ve bir proteaz inhibitörü içeren bir çözelti üzerine katmanlayın.

Katmanlar arasındaki yoğunluk farkı, süreksiz bir yoğunluk gradyanı oluşturur.

Hücre zarı parçaları arayüzde kalırken, sağlam hücreleri yerleştirmek için santrifüjleyin.

Süpernatanı atın. Hücreleri büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve plakalayın.

Büyüme faktörleri, nöral kök / progenitör hücrelerin çoğalmasını ve bunların üç boyutlu nöroküreler halinde toplanmasını seçici olarak teşvik eder.

Sıçan nöral kök hücrelerinin izolasyonuna başlamak için, diseke edilmiş periventriküler dokuyu 1 kübik milimetrelik parçalar halinde doğramak için mikro makas kullanın. Daha sonra, bir papain ayrışma kitinden bir papain şişesine önce 5 mililitre Earl'ün dengeli tuz çözeltisini ekleyerek enzimatik ayrışma tamponunu hazırlayın.

Şişeyi 10 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin, böylece papain tamamen çözülür ve çözelti berrak görünür. Daha sonra, ayrışma kitinden DNase şişesine 500 mikrolitre Earl'ün dengeli tuz çözeltisini ekleyin ve yavaşça karıştırın.

Papain içeren şişeye 250 mikrolitre DNaz çözeltisi ekleyin ve hafifçe karıştırın. Daha sonra, yaklaşık 0.2 gram olan kıyılmış dokuyu şişeye ekleyin ve şişeyi 45 dakika ila bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir külbütör platformuna yerleştirin.

İnkübasyondan sonra, bulanık bir hücre süspansiyonu elde etmek için kalan doku parçalarını ayırmak için karışımı 10 mililitrelik bir pipetle ezin. Hücre süspansiyonunu steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyin.

Santrifüjleme sırasında, 2.7 mililitre Earl'ün dengeli tuz çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpte 300 mikrolitre sulandırılmış albümin ovomkoid inhibitör çözeltisi ile karıştırarak ovomokoid çözeltisini hazırlayın. Daha önce hazırlanmış olan DNaz solüsyonundan 150 mikrolitre ovomukoid solüsyona ilave edin ve tüpü ters çevirerek karıştırın.

Süpernatanı peletlenmiş hücrelerden atın ve seyreltilmiş DNaz albümin inhibitörü karışımında hücre peletini hemen yeniden süspanse edin. Daha sonra, 15 mililitrelik bir tüpe 5 mililitre albümin inhibitör çözeltisi ekleyerek ve 5 mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu albümin inhibitörü çözeltisinin üzerine nazikçe ve yavaşça katmanlayarak süreksiz bir yoğunluk gradyanı hazırlayın.

Numuneyi oda sıcaklığında altı dakika boyunca 70 g'da santrifüjleyin. Bitirdikten sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini, ekteki metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlanan 1 mililitre önceden ısıtılmış sıçan EFH ortamında yeniden süspanse edin.

Bir hemositometre ile canlı hücre yoğunluğunu sayın ve hücreleri EFH'de mikrolitre başına 10 hücre yoğunluğunda bir T25 kültür şişesine yerleştirin. Şişeleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit içinde inkübe edin ve kürelerin toplanmasını önlemek için kültürlerin bir hafta boyunca rahatsız edilmeden büyümesine izin verin.

08:48

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ'una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:01

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:37

İzolasyon ve Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncüleri genişletilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:04

Doğum Sonrası Fare Beyinciğinden Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Nöral Hücrelere Farklılaşması

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:56

Şiddetli Spinal Kord Yaralanması sonra fibrin ve Büyüme Faktörü kokteyller ile Nöral Kök Hücre Survival ve Farklılaşma Tanıtım

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:27

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:52

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler'den Kök Hücre

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:56

Omurilik Yaralanması Deneysel Kontuzif Modelinde Sinir Kök Hücre Nakli

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:26

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:24

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 1 Ağustos 2026