Fare Serebral Perisitlerinin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Fare beyin dokusuna tampon ekleyin ve hücreleri ve mikro damarları serbest bırakmak için homojenize edin.

Ardından, homojenata BSA-dextran çözeltisini ekleyin. Bileşenleri ayırmak için karıştırın ve santrifüjleyin. Süpernatanı atın.

Mikro damarları tamponda yeniden süspanse edin ve daha büyük damarları çıkararak bir filtreden geçirin.

Şimdi, süzüntüyü santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. DNAses içeren tampondaki mikro damarları yeniden süspanse edin.

Endotel hücrelerini ve perisitleri serbest bırakmak için proteolitik enzimler ekleyin.

DNazlar DNA'yı bozar.

Enzim aktivitesini durdurmak için BSA içeren tampon ekleyin. Süpernatanı santrifüjleyin ve atın.

Hücreleri ortamdaki yeniden süspanse edin ve bunları bir bodrum matrisi kaplı çok kuyulu plaka üzerine yerleştirin. İnkübe edin, hücre yapışmasını teşvik edin.

Medyayı düzenli olarak değiştirin.

Endotel hücreleri tek tabaka oluşturur ve perisit büyümesini destekler.

Jelatin kaplı çok kuyucuklu bir plaka üzerinde perisit ortamında müteakip hücre geçişi, endotel hücrelerini ortadan kaldırırken perisit büyümesini teşvik eder.

Beyni patojen içermeyen dört ila altı haftalık bir erkek C57 siyah 6 fareden steril, kuru, tüy bırakmayan bir mendil üzerine yerleştirerek ve beyincik, striatum ve oksipital sinirleri çıkarmak için kavisli uçlu forseps kullanarak başlayın. Görünür tüm meninksleri çıkarmak için pamuklu çubuk kullanın ve beyin dokusunu ters çevirin. Lobları dışa doğru hafif vuruşlarla açın ve görünen tüm kan damarlarını çıkarın. Ardından, meninkssiz beyin dokusunu 15 mililitre soğuk Yıkama Tamponu B içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin.

Dokuyu homojenize etmek için, beyin örneğini bir Dounce Doku Öğütücü harç tüpüne aktarın ve tüpe 3 ila 4 mililitre Yıkama Tamponu B ekleyin. Dokuyu 55 kez kıymak için gevşek bir havaneli kullanın. Ardından, havaneli Yıkama Tamponu B ile durulayın ve doku bulamacını sıkı bir havaneli ile 25 kez kıyın. Homojenizasyonun sonunda, bulamacı iki 50 mililitrelik tüp arasına eşit olarak ayırın ve soğuk% 30 sığır serum albümini dekstranın 1.5 katı hacim ekleyin. Ardından, bulamacı karıştırmak için tüpleri kuvvetlice sallayın.

Vasküler fraksiyonu izole etmek için, hücreleri santrifüjleme ile çökeltin ve süpernatanları iki yeni tüpe aktarın. Peleti Yıkama Tamponu B'de buz üzerinde saklayın. Peletleri buz üzerinde üç mililitre soğuk Yıkama Tamponu B'de yeniden süspanse edin.

Hasat edilen süpernatanları santrifüjleyin ve bu adımı bir kez daha tekrarlayın. Süpernatanları atın ve peletleri 3 mililitre Yıkama Tamponu B'de yeniden süspanse edin. Ardından, yeniden süspanse edilmiş peletleri bir araya getirin ve havuzlanmış hücre süspansiyonlarının son hacmini taze soğuk Yıkama Tamponu B ile 10 mililitreye getirin.

Ayrıca, hücreleri 10 milimetrelik bir pipetle altı kez ayırın, ta ki kalan pelet kümeleri görünmeyene kadar ve hücre süspansiyonunu filtrelemek için bir vakumlu filtre tertibatı ve bir naylon ağ süzgeci kullanın. Süzgeci bir Petri kabına yerleştirin ve kılcal damarları kurtarmak için ağı taze Yıkama Tamponu B ve kazıma ile temizleyin. Ardından, yeni bir filtre ile ikinci bir filtreleme yapın.

Süzüntüyü iki tüp arasında eşit olarak bölün ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Süpernatanları attıktan sonra, peletleri enzimlerle önceden ısıtılmış Yıkama Tamponu B içeren tek bir tüpe toplayın ve tüpe önceden ısıtılmış kollajenaz dispas ekleyin. 30 mililitre soğuk Yıkama Tamponu B ile reaksiyonu durdurmadan önce tüpü 37 santigrat derecede tam olarak 33 dakika boyunca sallama masası su banyosuna yerleştirin.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı dikkatlice atın. Peleti hızlı ama dikkatli bir şekilde Yıkama Tamponu B'de altı kez yeniden süspanse edin ve süspansiyonu tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti mililitre tam DMEM ortamında yeniden süspanse edin ve üç Matrigel kaplı altı oyuklu plakanın dokuz oyuğunda tam DMEM'de 2 mililitre hücre süspansiyonu tohumlayın.

Hücre kültürlerini, her bir oyuktaki kalıntıları dikkatlice çıkarmadan önce 24 saat boyunca steril 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin ve taze DMEM ortamı ekleyin. 48 saat sonra, her 48 saatte bir her kuyucuktaki ortamı değiştirin. 8 ila 10. günlerde, hücreler% 100 birleşmeye ulaştığında, parazit kültürü ortamındaki hücreleri yeni jelatin kaplı altı oyuklu plakalara geçirin ve hücreleri, izleme ile 6 ila 7 gün daha hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.