$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Beynin hücre dışı matrisi veya ECM'si içinde nöral, nöral olmayan ve bağışıklık hücrelerine sahip bir murin beyni ile başlayın.
Dokuyu kıyın ve bir kültür ortamında yeniden süspanse edin.
Bu doku parçalarını bir tüpe aktarın ve kollajenaz ve DNaz-I enzimleri ile tedavi edin.
Kollajenaz, ECM'yi sindirerek tek tek hücreleri serbest bırakırken, DNase-I, hücre topaklanmasını önlemek için serbest DNA'yı bozar.
Ardından, kollajenaz enzimlerini etkisiz hale getirmek için EDTA ekleyin.
Bir kültür ortamı ekleyin. Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın.
Düşük yoğunluklu bir gradyan tabakası oluşturarak hücre peletine bir yoğunluk gradyan çözeltisi ve kültür ortamı ekleyin.
Bir yoğunluk farkı oluşturmak için çözeltiyi yüksek yoğunluklu bir gradyan çözeltisiyle karıştırın ve ardından altına yerleştirin.
Arayüzdeki bağışıklık hücrelerini ayırmak için düşük hızda santrifüjleyin, üstte daha hafif hücre kalıntıları ve altta daha ağır nöronal ve glial hücreler bulunur.
Üst tabakayı çıkarın ve bağışıklık hücrelerini toplayın ve başka bir tüpe aktarın.
Süpernatanı santrifüjleyin ve çıkarın, ardından hücreleri bir ortamda yeniden süspanse edin ve aşağı akış uygulamaları için tek hücreli bir süspansiyon oluşturun.
Beyin veya omurilik dokusunu ortamla birlikte 100 milimetrelik bir Petri kabına dökün ve dokuyu dibe doğru hareket ettirmek için forseps kullanın. Beyin dokusunu steril bir tıraş bıçağıyla kıyın ve dokuyu plakanın dibinde toplayın. Petri kabına% 10 FCS ile desteklenmiş 3 mililitre RPMI ekleyin, daha sonra ortamdaki dokuyu yeniden süspanse etmek için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın ve 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Dokuya kollajenaz tip I ve DNaz I ekleyin ve tüpleri 37 santigrat derece su banyosunda 40 dakika inkübe edin. Dokuyu enzimlerle iyice karıştırmak için tüpleri her 15 dakikada bir ters çevirin. İnkübasyondan sonra, 0.01 molar'lık bir son konsantrasyon için her tüpe EDTA ekleyin ve kollajenazı inaktive etmek için tüpleri beş dakika daha inkübe edin.
Her tüpe %10 FCS ile takviye edilmiş 9 mililitre RPMI ekleyin, ardından tüpleri 450 g'da 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletine dokunmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire etmek için vakumlu bir Pasteur pipeti kullanın.
Hücre peletine 3 mililitre %100 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin. Ardından, son hacmi 10 mililitreye getirmek için ek RPMI %10 FCS ortamı ekleyin ve hücre peletini yeniden süspanse edin. Tüpü ters çevirin ve iyice karıştırın. Ardından, tüpün dibine 1 mililitre% 70 stok izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi içeren serolojik bir pipet yerleştirin.
Kabarcık yapmamaya dikkat ederek çözeltiyi yavaşça altına alın. Gradyanı bozmamaya dikkat ederek serolojik pipeti tüpten çıkarın. Tüpü 800 g'da 4 santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin, ardından tüpte 2 ila 3 mililitre kalana kadar miyelin kalıntı tabakası da dahil olmak üzere süpernatanı aspire edin.
Hücre katmanını %30 ila %70 yoğunluk gradyanı arasında toplamak için 1 mililitrelik bir pipet kullanın ve bunu 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Son hacmi 15 mililitreye getirmek için RPMI% 10 FCS ortamı ekleyin, ardından hücreleri 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 450 g'da santrifüjleyin.