JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 3:43 dk • July 8th, 2025
Bir kenarına beyaz pedler ve beyaz LED ışıklar takılmış bir akrilik levha içeren yanal yumuşak ışık aydınlatma kurulumunu alın.
Öne embriyoid vücut oluşturma ortamı içeren düşük yapışma özelliğine sahip çok kuyulu bir plaka yerleştirin.
Embriyoid cisimciklerini veya EB'leri plakaya ekleyin.
LED ışık, akrilik levhanın yanından girer ve paralel ışınlar yayarak EB'leri yanal olarak aydınlatır ve çıplak gözle görselleştirmeyi mümkün kılar.
EB'leri merkeze yakınsayan bir girdap akışı oluşturmak için plakayı döndürün.
Harcanan ortamı taze EB oluşum ortamı ile değiştirin.
EB'leri geniş delikli bir pipet ucu kullanarak toplayın.
EB'lerin yerçekimi ile yerleşmesini sağlamak için pipeti dik tutun.
EB'leri bir nöral indüksiyon ortamı içeren başka bir düşük yapışma plakasına aktarın.
Ucu ortama dokundurun. EB'ler sıvı yüzey gerilimi nedeniyle batar.
Ortamdaki spesifik faktörler, EB'lerde nöral farklılaşmayı başlatarak bir nöroepitelyal tabaka oluşturur.
A5 kağıt boyutunda 0,3 ila 0,5 santimetre kalınlığında şeffaf bir akrilik levha kullanın ve akrilik plakanın önüne ve arkasına beyaz pedler yapıştırın. Ardından, plakanın kenarına bir dizi LED beyaz ışık yerleştirin, böylece ışıklar akrilik plakanın yanından girebilir ve ardından paralel olarak dışarı çıkabilir.
Şimdi, altı oyuklu yeni bir düşük yapışma plakası hazırlayın ve her oyuğa 2 mililitre EB oluşum ortamı ekleyin. EB'leri ortamla birlikte çıkardıktan sonra, 1000 mikrolitre geniş delikli pipet ucu kullanarak, oyuk başına yaklaşık 100 EB'yi 6 oyuklu düşük yapışma plakasına aktarın.
EB oluşum ortamını her gün aynı hacimde taze ortamla değiştirmek için, çanağı dairesel bir yörünge boyunca döndürerek bir girdap akışı indükleyin. EB'ler veya organoidler, dönme yoluyla üretilen ikincil akış nedeniyle kuyunun merkezine yakınsar. Kuyunun kenarına yavaşça pipetleyerek eski ortamı aspire edin. Çok sert emmeyin, aksi takdirde EB'ler birlikte çıkarılacaktır. Ardından, EB'leri yeniden askıya almak için yeni medya ekleyin.
Nöral indüksiyon için, oyuk başına 3 mililitre nöral indüksiyon ortamı olan 6 oyuklu düşük yapışma plakalı yeni bir plaka hazırlayın. Yanal yumuşak ışığı açın ve diğer iç mekan ışık kaynaklarını kapatın. Şimdi, hem EB'leri hem de kültür ortamını emmek için geniş ağızlı bir pipet ucu kullanarak EB'leri eklenen nöral indüksiyon ortamı ile 6 oyuklu plakaya aktarın. Ardından pipeti dik tutun. EB'ler yerçekimi altında yavaş yavaş batacak ve pipet ucunun ağzına doğru birleşecektir.
Pipet ucunun ağzı sıvı yüzeyine tekrar temas ettiğinde ve sıvı yüzey gerilimi nedeniyle EB'ler hızla ortama batar. Numuneleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat inkübe edin.